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如何進(jìn)行PCR擴(kuò)增DNA
最近更新時(shí)間：2022-4-2
提 供 商：上海士鋒生物科技有限公司資料大?。?/span>40KB
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聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，1985年由Mullis等人創(chuàng)立。該技術(shù)能在幾小時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作中，將人為選定的一段DNA擴(kuò)增幾百萬倍，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便和應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為分子生物學(xué)及基因工程中極為有用的研究手段，另外在醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷中亦體現(xiàn)出極大的應(yīng)用價(jià)值。
PCR的工作原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNA片斷和與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)變性、退火及延伸三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使特定的DNA片斷在數(shù)量上呈指數(shù)增加。PCR擴(kuò)增首先需要一對引物，根據(jù)待擴(kuò)增區(qū)域兩側(cè)的已知序列合成兩個(gè)與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴(kuò)增片段的特異性和片段長度。反應(yīng)體系由模板DNA、一對引物、dNTP、耐高溫的dna聚合酶、酶反應(yīng)緩沖體系及必須的離子等所組成。PCR反應(yīng)循環(huán)的*步為加熱變性，使雙鏈模板DNA變性為單鏈；第二步為復(fù)性，每個(gè)引物將與互補(bǔ)的DNA序列雜交；第三步為延伸，在耐高溫的DNA聚合酶作用下，以變性的單鏈DNA為模板，從引物3ˊ端開始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA鏈。這樣經(jīng)過一個(gè)周期的變性——復(fù)性——延伸等三步反應(yīng)就可以產(chǎn)生倍增的DNA，假設(shè)PCR的效率為*,反復(fù)n周期后，理論上就能擴(kuò)增2n倍。PCR反應(yīng)一般30-40次循環(huán)，DNA片段可放大數(shù)百萬倍。
常規(guī)PCR反應(yīng)用于已知DNA序列的擴(kuò)增，變性溫度為95℃，復(fù)性溫度為37℃～55℃，延伸合成溫度為72℃，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受95℃左右的高溫而不失活），反應(yīng)循環(huán)數(shù)為30。
【實(shí)驗(yàn)材料】
1.實(shí)驗(yàn)器材
PCR擴(kuò)增儀，臺(tái)式高速離心機(jī)，移液器，經(jīng)高壓滅菌后的eppendorf管，電泳儀。
2.實(shí)驗(yàn)試劑
（1）模板DNA（0.1µg/µl）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50µl的裂解液中（裂解液1%TritonX-100，20mmol/l Tris-HCl PH 8.2, 2mmol/l EDTA）, 95℃溫浴10分鐘, 10000rpm離心5分鐘,取2µl上清液用于總體積50µl的PCR反應(yīng)。
（2）TaqDNA聚合酶（5U/µl），10×擴(kuò)增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買
（3）引物（100pmol/L）：設(shè)計(jì)并合成與目的DNA兩側(cè)互補(bǔ)的引物內(nèi)。
【實(shí)驗(yàn)操作】
1．準(zhǔn)備PCR反應(yīng)溶液
（1） 按以下次序，將下列成分在0.5ml滅菌Eppendorf管內(nèi)混合：
10×擴(kuò)增緩沖液 10µl
4×dNTPs(包括四種dNTP) 8µl
引物1 1µl
引物2 1µl
模板DNA 1µl (10ng)
Taq DNA聚合酶 1µl (2.5U)
加水至終體積 100µl
（2） 用手指輕彈Eppendorf管底部，使溶液混勻。在臺(tái)式離心機(jī)中離心2秒以集中溶液于管底。
（3）加石蠟油50µl封住溶液表面。