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士鋒生物關(guān)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及hanks液實(shí)驗(yàn)技巧

最近更新時(shí)間：2013-4-21

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相關(guān)產(chǎn)品：

細(xì)胞生物學(xué)生物大實(shí)驗(yàn)的時(shí)候有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的大實(shí)驗(yàn)，在這里詳細(xì)介紹了細(xì)胞培養(yǎng)中各種器皿的清晰和滅菌、培養(yǎng)基的配制、hanks液/d-hanks液等試劑的配制、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及其凍存與復(fù)蘇方法與操作步驟。

細(xì)胞培養(yǎng)是用無(wú)菌操作的方法將動(dòng)物體內(nèi)的組織（或器官）取出，模擬動(dòng)物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng).使其不斷地生長(zhǎng)、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命現(xiàn)象。

細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和分化等的影響;二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞骨架等）、細(xì)胞生長(zhǎng)及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律的—種簡(jiǎn)便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素，那就是它脫離樂生物機(jī)體后的—些變化。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等

這次的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)精細(xì)的，需要有步驟、有計(jì)劃的進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。主要步驟有：1、清洗與滅菌;2、培養(yǎng)基配制;3、Hanks、D-Hanks液和消化液的配制、4、細(xì)胞傳代培養(yǎng);5、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇。可分幾次小實(shí)驗(yàn)進(jìn)行操作。

Ⅰ清洗與滅菌

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的各種器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的*步，是組織培養(yǎng)中工作量zui大，也是zui基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不*有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無(wú)油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，哪怕殘留0.1個(gè)，也可能影響細(xì)胞生長(zhǎng)。滅菌手段的選擇十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。

三、實(shí)驗(yàn)材料、用品

1、材料：無(wú)臭氧型紫外燈，微孔濾膜（直徑25）：孔徑為0.22μm，微孔濾膜（直徑90）：孔徑為0.22 μm，過濾器（直徑25）。

2、藥品：70%或75%酒精，0.1%新潔爾滅，煤酚皂溶液（來(lái)蘇兒水），0.5%過氧乙酸，乳酸，37%甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸（工業(yè)），DEPC水[體積分?jǐn)?shù)0.1%的焦炭酸二乙酯（diethylpyroearbonate）]。

3、儀器：超凈臺(tái)，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）實(shí)驗(yàn)器具清洗

l 玻璃類 1、主要有：培養(yǎng)瓶，血清瓶，小青瓶，移液管，離心管，試管，培養(yǎng)皿等。

2、清洗步驟：

泡在含有洗潔凈的自來(lái)水中→撈出來(lái)用毛刷將實(shí)驗(yàn)器具各個(gè)面刷洗至少25遍→自來(lái)水沖洗25遍→過一遍一蒸水→泡入鉻酸,過夜（24h左右）→從鉻酸中撈出器具，自來(lái)水沖洗25遍→過三遍一蒸水，三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子備用→用前高溫滅菌（121℃，25min）→烘干→使用。

注意：新的玻璃器具先要泡鹽酸1天，然后清洗步驟與上面相同。

l 塑料類

1 塑料類器具主要包括：孔板，大槍頭，瓶蓋，濾器，采血管等。

2 清洗步驟：

（1）孔板，采血管

泡在有洗潔凈的自來(lái)水中→用超聲清洗儀超聲3遍（每遍1小時(shí)，200C）→在含有洗潔凈的自來(lái)水中用毛刷或者紗布將各個(gè)面刷洗至少25遍→過一遍一蒸水→泡入鹽酸過一個(gè)禮拜→從鹽酸中撈出后自來(lái)水沖洗25遍→過三遍一蒸水（每遍3次），三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好照鈷→使用

（2）大槍頭，蓋子，濾器

在含有洗潔凈的自來(lái)水中用毛刷或者紗布將各個(gè)面刷洗至少25遍→用超聲清洗儀超聲1遍（每遍45分鐘，200C）→自來(lái)水沖洗→過三遍一蒸水（每遍3次），三遍三蒸水→烘箱內(nèi)烘干→收入柜子→用前包裝好滅菌→使用

注意：（1）烘孔板時(shí)溫度不應(yīng)太高，烘干后用報(bào)紙包裹，裝入箱子內(nèi)，照鈷，便可使用。

（2） 新的培養(yǎng)瓶蓋子泡舊5%稀鹽酸1天→再用2%NaOH煮20min →自來(lái)水沖洗→洗潔精清洗→用超聲清洗儀超聲1遍（每遍45分鐘，200C）→沖洗15遍→過三遍一蒸（每遍3次）→過三遍三蒸水→烘干使用

（二）包裝與消毒

2、包裝

洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。比如小青瓶，試管，移液管，血清瓶，培養(yǎng)瓶，離心管，孔板，槍頭，針式濾器等的包裝。其中針式濾器包裝之前要裝好濾膜，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中 。

2.1 包裝分類

局部包裝：較大瓶皿如細(xì)胞培養(yǎng)瓶，燒杯，容量瓶，三角瓶， 消毒筒以及體積較小，但瓶口包裝方便的容器如青霉素瓶等的包裝，通常采用局部包裝。

全包裝：體積較小的培養(yǎng)瓶皿，注射器，膠塞及不便局部包裝的用具如金屬器械等，需采用全包裝，現(xiàn)多采用直接裝入鋁飯盒的方法。用鋁飯盒來(lái)封裝小培養(yǎng)瓶，膠塞和膠帽等很好，但往往因蓋不嚴(yán)緊使用期限不宜太長(zhǎng)。因鋁飯盒不透明，在蓋子宜寫上用品名稱以便于確認(rèn)，吸管在裝入消毒筒之前，先用少許脫脂棉將吸管接口端堵塞，松緊度適宜，過松易脫落，過緊不透氣，妨礙使用;然后裝入消毒筒中，消毒筒底部應(yīng)墊以軟紙或棉花以防吸管裝入時(shí)折斷管尖;zui后再包裝入筒中封口。

2.2 注意

包裝之前玻璃器皿蓋子要擰松。

2、 消毒滅菌概念

消毒 具有殺死致病微生物的作用或方法，稱為消毒。通常只能消滅物體表面或環(huán)境中的一部分微生物，有能達(dá)到消滅所有微生物。

滅菌 指*殺菌，即用物理或化學(xué)等方法，殺死物體上的一切微生物，以及它們的芽胞和孢子，使物體成為無(wú)菌狀態(tài)。

2.1 消毒滅菌方法

2.1.1 物理消毒滅菌法

通過高潮、射線、微波以及器械進(jìn)行滅菌或除菌的方法均為物理滅菌方法。

（1）紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺(tái)面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。

（2）干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放人干燥箱內(nèi)，加熱至160℃，保溫90-120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180℃，保溫5-8 h。

（3）濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是zui有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品（如膠塞）、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無(wú)機(jī)溶液（如Hanks液、PBS、20×SSC等）。手動(dòng)高壓滅菌鍋操作如下：

①首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。

②加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣5—10 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。

③待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅（121℃）30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115 ℃）20 min。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。

④停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。

電熱自動(dòng)滅菌鍋使用說明（型號(hào)：SANYO Autoclave MLS-3020）：

①放氣筒加水至LOW水平線處，將與高壓鍋相連的導(dǎo)氣管插入放氣筒里，然后將放氣筒歸于原位。

②打開高壓鍋蓋，加入蒸餾水至高壓鍋底的水位線，水位線位于V型凹槽的1/3-2/3處。

③打開電源。

④設(shè)定高壓溫度及時(shí)間，高壓鍋的溫度范圍為105-121℃，高壓滅菌一般采用121℃20—30 min。

⑤把待高壓的物品置于高壓鍋內(nèi)，順時(shí)針方向?qū)xhaust鈕旋至close位置。

⑥關(guān)閉高壓鍋蓋，旋至顯示屏上左上角的紅亮點(diǎn)剛出現(xiàn)為止。

⑦按start鈕，開始高壓，在溫度達(dá)80℃時(shí)顯示器開始顯示溫度，當(dāng)溫度達(dá)到所需的設(shè)定溫度時(shí)，在顯示屏的左下角有一長(zhǎng)形的指示燈閃亮，直到高壓時(shí)間結(jié)束后指示燈滅，此時(shí)蜂鳴器報(bào)警一聲。當(dāng)壓力降至0 MPa時(shí)，蜂鳴器再報(bào)警一聲。溫度降至80℃時(shí)，蜂鳴器報(bào)警10次。顯示屏溫度指示消失，此時(shí)才可打開鍋蓋。

⑧關(guān)電源，開高壓鍋蓋，取出已滅菌的物品，烘干。

（4）濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號(hào)按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號(hào)的金屬濾器（直徑90 mm、100 mm、142 mm……等），配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動(dòng)的塑料小濾器（直徑20 mm、25 mm等）。濾膜孔徑有0.60 μm、0.45 μm、0.35 μm、0.22 μm、0.10μm等，以0.22 μm除菌zui為保險(xiǎn)，但對(duì)于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

①在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22μm。

②用布包好，濕熱滅菌后使用。

2.2.2化學(xué)消毒法

常用的消毒液有如下幾種：

（1）70%（或75%）酒精：超凈臺(tái)里常備70%酒精棉球（衛(wèi)生級(jí)酒精），用于手和一些金屬器械或工作臺(tái)面的消毒。

（2）0.1%新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺(tái)面的清潔。超凈臺(tái)旁應(yīng)常備盛有0.1%新潔爾滅溶液的容器及紗布。

（3）來(lái)蘇兒水（煤酚皂溶液）：主要用于無(wú)菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請(qǐng)按瓶上說明。

（4）0.5%過氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。

（5）乳酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉1—3 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。

（6）37%甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37%甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。1—3 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。

3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。

五、注意事項(xiàng)

1.清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來(lái)水沖洗10—15次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?duì)細(xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬(wàn)不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗。如沒有洗凈會(huì)影響下一次使用的效果。

2.干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100℃時(shí)，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100℃之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。.

3.高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。

4.牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓（如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等）。

5.濾過除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜（有時(shí)可在上面加一層定性濾紙），包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過濾時(shí)壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。

6.使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75%酒精應(yīng)用衛(wèi)生級(jí)，不要用化學(xué)純、分析純和純酒精。來(lái)蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對(duì)皮膚有刺激性。空氣消毒時(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱?duì)人的角膜和呼吸道上皮有嚴(yán)重的刺激和傷害作用。

Ⅱ、培養(yǎng)基的配制

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

熟練掌握培養(yǎng)基（RPMI1640和DMEM）的配制，了解其他培養(yǎng)基配制方法。

二、 實(shí)驗(yàn)原理

組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必須得生長(zhǎng)因子、激素、貼附因子等，這是合成培養(yǎng)基所無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)的毒性。故一般體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)要加入一定量的小牛血清（10%-20%）。

三、 儀器、材料和試劑

儀器：濾泵一套、濾器一套、蒸餾器、高壓滅菌鍋、磁力攪拌器。

材料：3000ml錐形瓶、250ml或500ml培養(yǎng)瓶、翻冒塞、飯盒、pH試紙、孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：鹽酸、無(wú)離子水、小牛血清、合成培養(yǎng)基（RPMI1640）、青霉素、鏈霉素、NaHCO3。

四、 實(shí)驗(yàn)步驟

（一） 準(zhǔn)備和安裝濾器

在超凈工作臺(tái)內(nèi)打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無(wú)損。

（二） 合成培養(yǎng)基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時(shí)間（2-4h）使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈工作臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養(yǎng)瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲(chǔ)存（可以-20℃儲(chǔ)存）。

（三） 小牛血清的處理

市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時(shí)的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲(chǔ)存于4℃;

3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

（四） 生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制

除無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養(yǎng)基分裝成小瓶（100ml-200ml）以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養(yǎng)基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液（青霉素+鏈霉素），使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事項(xiàng)

1、 培養(yǎng)細(xì)胞使用的瓶子和飯盒應(yīng)與提取RNA和培養(yǎng)細(xì)菌的瓶子和飯盒嚴(yán)格分開。因?yàn)橛糜谔幚硖崛NA的DEPC水（0.1%焦炭酸二乙酯）是一種致癌物，可能影響細(xì)胞生長(zhǎng);而培養(yǎng)過細(xì)菌的用品也不應(yīng)與細(xì)胞混用。

2、 過濾時(shí)壓力不可過大，否則細(xì)菌易濾過達(dá)不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時(shí)需根據(jù)使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時(shí)瓶子易爆或膠塞自噴。

3、 濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。

Ⅲ、Hanks、D-Hanks液和消化液（胰酶液）的配制

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液（胰酶液）的配制方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

Hanks液是常見的平衡鹽溶液（BSS）之一。D-Hanks液則是無(wú)鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無(wú)菌狀態(tài)一致，且配方簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。胰蛋白酶（胰酸）溶液是一種常用的細(xì)胞消化液，原代培養(yǎng)時(shí)用于處理組織塊，使細(xì)胞分離下來(lái)。傳代時(shí)用胰蛋白酶使培養(yǎng)細(xì)胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實(shí)驗(yàn)室一般用1：250（GRC公司生產(chǎn)）。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來(lái)說濃度大、溫度高（勿高于37℃）、作用時(shí)間長(zhǎng)，則對(duì)細(xì)胞分離能力大。但超過一定程度會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時(shí)消化能力zui強(qiáng)。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會(huì)降低胰酶活力，所以配制胰酶時(shí)須用無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時(shí)，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。

三、儀器、試劑和材料

材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。

試劑：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅（0.1%）（配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進(jìn)該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用）。

儀器： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）配制D-Hanks液

1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。

2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。

（二）配制Hanks液

1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。

2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中（夏天時(shí)研磨器應(yīng)放在冰浴中），加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。

3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右（胰酶作用的zui適pH值），并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。

4.濾過除菌（方法見二、培養(yǎng)基的配制），-20℃凍存。

五、注意事項(xiàng)

1.BSS的pH值應(yīng)確定為7.2左右。

2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無(wú)菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。

3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應(yīng)始終保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時(shí)會(huì)將較大的顆粒過濾掉，不能達(dá)到真正的濃度。

5.胰酶分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)體積會(huì)膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會(huì)降低消化效果并可能造成污染。

Ⅳ、傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

熟練傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長(zhǎng)因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無(wú)菌條件。

三、儀器、材料和試劑

儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)

材料：培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養(yǎng)的細(xì)胞。

試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、入無(wú)菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;

2、倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。 將培養(yǎng)用液37℃下預(yù)熱。

3、超凈臺(tái)臺(tái)面應(yīng)整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;

4、打開超凈工作臺(tái)的紫外燈照射臺(tái)面20min左右，關(guān)閉紫外燈，打開風(fēng)機(jī)清潔空氣出去臭氧;

5、點(diǎn)燃酒精燈;取出無(wú)菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無(wú)菌試管內(nèi)。

6、將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。

7、倒掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。

8、每個(gè)大培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，小培養(yǎng)瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細(xì)胞提早脫落入消化液中。

9、加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補(bǔ)加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基（7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶）制成細(xì)胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。

10、對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，步驟7-9不做。直接將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。

五、注意事項(xiàng)

1、傳代培養(yǎng)時(shí)注意無(wú)菌操作并防止細(xì)胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進(jìn)行一種細(xì)胞的操作。每種細(xì)胞使用一套器材。

2、每天觀察細(xì)胞形態(tài)，掌握好細(xì)胞是否健康的標(biāo)準(zhǔn)：健康細(xì)胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長(zhǎng)致密時(shí)即可傳代。

3、如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染跡象，應(yīng)立即采取措施，一般應(yīng)棄置污染的細(xì)胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養(yǎng)基反復(fù)清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基。

Ⅴ、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

掌握細(xì)胞保存的方法，能獨(dú)立地進(jìn)行細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇操作。

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到保種的作用。此外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式購(gòu)買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。

細(xì)胞凍存時(shí)向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%-15% 的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點(diǎn)降低，加之在緩慢凍結(jié)條件下，在細(xì)胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細(xì)胞損傷。

采用“慢凍快融”的方法能較好的保證細(xì)胞的存活。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度為-1~-2℃/min，當(dāng)溫度低于-25℃時(shí)加速，到-80℃之后直接投入液氮內(nèi)（-196℃）。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)則直接將裝有細(xì)胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。

三、儀器、試劑和材料

儀器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加樣器、水浴鍋、離心機(jī)。

材料：凍存管、細(xì)胞培養(yǎng)用材料、500ml燒杯、膠布、搪瓷杯、75%酒精棉球。

試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜（DMSO）或甘油、0.5%臺(tái)盼籃染液、液氮。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）細(xì)胞凍存

1、取待凍存的細(xì)胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來(lái)。800r/min離心5min，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，可直接離心收集細(xì)胞。

2、加入適量?jī)龃嬉海?0%甘油+90%培養(yǎng)基，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基）制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞濃度宜大，3*106個(gè)/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。

3、細(xì)胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標(biāo)記（注明細(xì)胞種類、時(shí)間、條件等）。

4、凍存管在4℃下存放30min，轉(zhuǎn)放-20℃1.5h~2h，再轉(zhuǎn)入-70℃4~12h后即可轉(zhuǎn)入液氮內(nèi)（-196℃），注意進(jìn)行登記。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1、取一搪瓷杯盛上適量自來(lái)水加熱至40℃左右。

2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。

3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。

4、離心去上清收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

5、每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，如果死細(xì)胞較多，復(fù)蘇次日應(yīng)換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

五、注意事項(xiàng)

1、在使用含有DMSO的凍存液時(shí)，因?yàn)镈MSO在室溫狀態(tài)易損傷細(xì)胞，所以在細(xì)胞加入凍存液后應(yīng)盡快放入4℃環(huán)境中。

2、準(zhǔn)確記錄細(xì)胞的種類、凍存時(shí)間、凍存液的品種和凍存者信息。

小結(jié)：這里總結(jié)了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的從器材消毒、試劑配制、細(xì)胞的凍存復(fù)蘇操作技術(shù)，希望對(duì)大家有用。

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