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PCR各處應用模式
點擊次數(shù)：817 發(fā)布時間：2017-8-16
一、兼并引物（Degenerate primer）PCR
密碼子具有兼并性，如表22-4，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不的，但可以設計成對兼并引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應相同。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強，設計引物時應盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析。現(xiàn)已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關(guān)肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷（deoxyinosine；DI）引物進行PCR，可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。
表22-4 密碼兼并性
氨基酸
密碼子數(shù)
M、W
1
C、D、E、F、H、K、N、Q、Y
2
I
3
A、G、P、T、V
4
L、R、S
6
注：選擇使用的肽鏈避開有4～6個密碼子的氨基酸
二、套式引物（Nested Primer）PCR
用*套引物擴增15～30個循環(huán)，再用擴增DN片段內(nèi)設定的第二套引物擴增15～30個循環(huán)，這樣可使待擴增序列得到擴增，而次級結(jié)構(gòu)卻很少擴增。用起始引物*或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心，在第二套引物加入前去除*引物。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細胞AS52的分子突變。AS52細胞含有單拷貝的細胞gpt（guanine phos－phribosy transferase）基因，與哺乳動物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。對環(huán)境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴增是非常有效的。
若將套式PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長外引物長度（至25～30bp），同進縮短內(nèi)引物長度（15～17bp），使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環(huán)擴增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴增的基礎上作低溫火溫度的三溫循環(huán)直到擴增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時加入，兩種循環(huán)一氣呵成，等于只做一次PCR，而靈敏度與套式二次PCR無異，在我們zui近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環(huán)儀上就可以完成全部程序。
套式一次PCR的成功，使pcr檢測的全過程可以在5h內(nèi)完成，使當天出檢驗報告成為現(xiàn)實，也使PCR檢測走入臨床有了現(xiàn)實的基礎。
三、復合PCR（Multiplex PCR）
用多對引物同時擴增幾條DN片段的方法稱為復合PCR。這一方法zui初是由Chanberlain 等檢測人的基因發(fā)展而來。Bej等隨之發(fā)展了對環(huán)境樣品中不同屬細菌相關(guān)基因序列同時PCR擴增的檢測方法。兩種不同的軍團菌（legionella）基因，一為特異嗜肺L基因（mip），另一種為L-5SrRNA基因，通過引物搖擺（staggered）添加進行復合PCR。首先mip引物PCR擴增7個循環(huán)，然后加入5SrRNA引物PCR擴增38個循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。