FSQ-201東洋紡TOYOBO反轉錄試劑盒

zui適用于Realtime PCR用cDNA合成的預混型逆轉錄試劑。 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201)是利用本公司高性能逆轉錄酶『ReverTra Ace』開發(fā)的Realtime PCR用的逆轉錄試劑盒，是包含逆轉錄反應用的所有組分的5×濃度的*預混型試劑，只需添加模板RNA和水即可迅速地開始反應。另外，由于采用了zui適用于Realtime PCR用短鏈目的片段cDNA合成的反應組成，可在短時間內高效率地制備適用于Realtime PCR的cDNA模板。   ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)中添附了具有強力DNA分解活性的gDNA Remover，通過在逆轉錄反應前處理模板RNA，可簡便地制備不含基因組DNA的cDNA。zui適用于檢測目的基因中存在假基因，或無法在橫跨內含子的位置上設計引物，模板RNA中有基因組DNA殘留問題等Realtime PCR實驗。 【相關產(chǎn)品】Realtime PCR試劑的詳細內容請點擊這里。 FSQ-201東洋紡TOYOBO反轉錄試劑盒 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix

特征1. *預混型試劑
本試劑是在−20℃條件下也不會凍結的*預混型試劑。只需添加模板RNA和水，即可簡便地合成重復性良好的cDNA。

特征2. 逆轉錄反應(−)對照溶液容易配制
由于添附有同樣預混型的no-RT Control，逆轉錄反應（−）對照溶液也很容易配制。

特征3. 實現(xiàn)了更廣的可定量擴增區(qū)域（dynamic rang）
由于采用了Oligo dT和Random Primer按*比例混合的primer mix，RNA的整個區(qū)域可進行均一、高效率的逆轉錄反應。因此，可對更廣的可定量擴增區(qū)域進行分析。

特征4. 與Realtime PCR試劑的高適應性
采用了對Realtime PCR的反應體系影響zui小的組分，即便向PCR反應液中帶入zui多20%液量的逆轉錄反應液，也能顯示出很好的線性。zui適用于低表達量mRNA的高靈敏度檢測。

特征5. 可簡便、迅速地去除基因組DNA<ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover>
按順序添加去除基因組DNA的試劑和逆轉錄反應試劑，只需20分鐘即可配制不含基因組DNA的cDNA。
 

以HeLa total RNA100ng為模板，按各公司試劑盒的推薦條件進行逆轉錄反應，再用Realtime PCR對5種目的基因進行定量。
結果可見，用本試劑盒可得到zui高合成量。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201）及其他公司同類型（預混型）產(chǎn)品 模板：HeLa total RNA 100ng /10μl反應體系 反應條件：各公司試劑盒推薦的條件

●Realtime PCR
試劑：THUNDERBIRD SYBR^® qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反應體系(帶入量10%)
目的片段：代表性基因5種
測定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

為評價模板RNA量對逆轉錄合成效率的影響，以HeLa total RNA 2pg?2μg（8個梯度）為模板進行逆轉錄反應，再用Realtime PCR對5種目的基因進行定量。結果可見，5種目的基因的標準曲線沒有交叉，顯示了很好的直線性。由此可見，用本試劑盒可對各種濃度范圍的RNA進行同等效率的逆轉錄。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No.FSQ-201） 模板：HeLa total RNA 2pg-2μg /20μl反應體系 ●Realtime PCR 試劑：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix（Code No.QPS-201） 模板：上述cDNA2μl/20μl反應體系（帶入量10%） 目的片段：代表性House Keeping Gene 5種 測定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

為了確認gDNA Remover去除基因組DNA的效果，按以下條件進行了逆轉錄反應，再以β-Actin為目的片段進行Realtime PCR。
結果可見，gDNA Remover處理（＋）、逆轉錄（−）<下面③>的條件下無法確認到擴增，說明基因組DNA已被去除。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301） 模板：自制的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反應體系 條件：用gDNA Remover添加（＋）、或不添加（−）的4×DN Master Mix去除gDNA后，再分別用5×RT Master MixⅡ或5×RT Master Mix Ⅱ no-RT Control進行逆轉錄反應

●Realtime PCR
試劑：THUNDERBIRD SYBR^® qPCR Mix（Code No.QPS-201）
模板：上述cDNA 2μl/20μl反應體系（帶入量10%）
目的片段：ACTB（188bp）
測定用儀器：Applied Biosystems 7900HT
 

向HeLa total RNA中添加過量的人基因組DNA，通過該實驗，與其他公司同類型產(chǎn)品比較去除基因組DNA的效果。
結果可見，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover去除基因組DNA的效果。

●cDNA合成 試劑：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（Code No.FSQ-301）及其他公司同類型試劑盒2種 模板：HeLa total RNA（0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng,100ng, 1μg）＋人gDNA 100ng/20μl反應體系 條件：各公司試劑盒的推薦條件 ●Realtime PCR 試劑：THUNDERBIRD SYBR® qPCR Mix（Code No.QPS-201） 模板：上述cDNA 2μl/20μl反應體系（帶入量10%） 目的片段：ACTB（188bp） 測定用儀器：Applied Biosystems 7900HT

Q1. 推薦反應時間為15分鐘，如果延長時間能否提高cDNA的合成量？
A1. tRNA等量很多的RNA全部進行逆轉錄反應時，延長反應時間可提高收量，但一般情況下推薦37℃15分鐘可得到足夠的cDNA。

Q2. 哪些RNA可作為模板RNA使用？  
 A2. Total RNA、mRNA、tRNA、rRNA等各種RNA都可以使用。

Q.3 是否需要RNase H處理？  
 A3. 由于模板RNA的殘留會對PCR產(chǎn)生抑制作用，一般情況下，逆轉錄反應結束后需通過RNase H對模板RNA進行分解。但本試劑盒采用了本公司新開發(fā)的系統(tǒng)，模板RNA在逆轉錄反應后會被非酶性去除，因此逆轉錄反應后無需進行RNase H處理。
 

1）K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226（2003）
2）A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66（2002）
3）S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246（2002）
4）S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460（2001）
5）Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675（2000）
6）S.Lee et al.,Gene,245:253−266（2000）