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青島捷世康生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第12年

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厭氧培養(yǎng)系列
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乳酸含量(lactic acid ,LA )試劑盒說明書

時(shí)間:2019/12/17閱讀:2036
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乳酸含量(lactic acid ,LA )試劑盒說明書可見分光光度法

                                               規(guī)格:50管/24樣

注意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物,與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān),乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。

測(cè)定原理

乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸,同時(shí)使NAD+還原生成NADH和H+,H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原INT生成紅色物質(zhì),在530nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液:液體 55mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 8mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 12mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:粉劑×1 支,-20℃避光保存。臨用前加入1.2mL蒸餾水充分溶解。

試劑四:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加12mL蒸餾水充分溶解。

試劑五:粉劑×1 支,4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體 1mL×1 支,4℃保存。

顯色液:臨用前根據(jù)用量按照提取液(V):試劑三(V):試劑四(V):試劑五(m)=1:

0.3:3:15(mg)的比例充分混勻。

樣本處理

1. 組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,12000g離心10min,取上清測(cè)定。

2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);于 4℃,12000g 離心10min,取上清測(cè)定。

3. 血清:直接測(cè)定。

測(cè)定操作

 

 

空白管

樣品對(duì)照管

樣品測(cè)定管

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管

標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管

樣品(μL)

 

50

50

 

 

標(biāo)準(zhǔn)品(μL)

 

 

 

50

50

H2O(μL)

500

300

450

300

450

試劑一(μL)

 

150

 

150

 

試劑二(μL)

200

200

200

200

200

顯色液(μL)

300

300

300

300

300

充分混勻,于 37℃反應(yīng) 30min,于 1mL 玻璃比色皿,空白管調(diào)零,測(cè)定 530nm 處吸光值,

分別記為 A1,A2,A3,A4,△A 樣=A2-A1;△A 標(biāo)= A4-A3

測(cè)定操作

注意:空白管、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管和標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需測(cè)定一次

計(jì)算公式

1. 按照蛋白含量計(jì)算

LA 含量(μmol/mg prot)=△A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ Cpr

=2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

LA 含量(μmol/g)=△A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ W

=2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

LA 含量(μmol/104cell)=△A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

=2×△A 樣÷△A 標(biāo)÷ 細(xì)胞數(shù)量

4. 按照液體體積計(jì)算

LA 含量(μmol/mL)=△A 樣÷△A 標(biāo)×C 標(biāo)

=2×△A 樣÷△A 標(biāo)

C 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)品濃度,2mmol/L ;W:樣本質(zhì)量,g/mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL

注意事項(xiàng)

1. 空白管、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定管只需做一次。

2. 若吸光值超過 1.2,請(qǐng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 低檢出限為 1.8μmol/L。數(shù),500 萬(wàn)。

 

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