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ABC-ELISA免疫標記技術(shù)

時間:2015-8-19閱讀:1820
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ABC-ELISA免疫標記技術(shù)


借助親和素之間*的親和力,至少要比抗原和抗體之間的結(jié)合高1萬被,且兩者結(jié)合迅速而穩(wěn)定,故用于免疫標記技術(shù)中,可提高檢測靈敏度,并可縮短反應(yīng)時間。在包被寄生蟲抗原的反應(yīng)板凹孔中,加寄生蟲感染者血清后,即形成抗原-抗體復合物,再加生物素標記的羊抗人IgG(Biotin-IgG),即與復合物相結(jié)合,再加ABC復合物(親和素-生物素-酶結(jié)合物),即可biotin-IgG相結(jié)合,zui后用相應(yīng)底物進形顯色反應(yīng)后,用分光光度計測定消光值,即可判讀反應(yīng)結(jié)果。

抗原制備 參考免疫酶測定法部分的抗原制備方法。

生物素標記羊抗人IgG 羊抗人IgG 血清經(jīng)50%和33%飽和硫酸銨各鹽析一次,收集γ球蛋白部分,透析后測定蛋白質(zhì)含量。林用錢,用0.1mol/L NaHCO3配成1mg/ml 濃度。將生物素用N-羥基丁二酰亞胺進行酯化反應(yīng),使稱為酯化生物素,然后用二甲基甲酰胺配成10mg/ml濃度以每mg抗球蛋白加0.2-0.4mg酯化生物素的比例,將酯化生物素二甲基甲酰胺溶液加入于羊抗IgG中,震蕩10min,置于是穩(wěn)中3-4h,然后用PBS透析24h,多次換液后,即為生物素標記物,保存?zhèn)溆谩?/span>

生物素標記辣根過氧化物酶  案上訴生物素標記羊抗人IgG方法,制備生物素標記沒

ABC溶液配制 在圖文-PBS中,分別加入avidin和HRP-Bio,使各自的zui終濃度為8-12ug/ml和3-4ug/ml,置室溫中混勻20-30min,即可應(yīng)用,通常在臨用前30min配制。

在以包被抗原的40孔反應(yīng)板凹孔中,加待測血清,如ELISA法孵育、洗滌后,加biotin-IgG如賞罰孵育,洗滌、再加ABC洗滌,于37℃經(jīng)15min,洗滌后加底物(鄰苯二胺OPD),置37℃經(jīng)10-15min,zui后用2mol/L H2SO4終止反應(yīng),用酶標檢測儀測定OD值,檢測時每一樣本做2分,求得均值。

以健康人測得的OD均值,加2個標準差作為標準值(N0.求每一受檢驗本的OD值(P)與N值的比值。以P/N≥1.5-2.0,作為陽性,否則為陰性。

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