更安全更快速的再生醫(yī)學策略：利用直接重編程改變細胞身份

在死亡之前，已變成皮膚細胞的細胞仍然是皮膚細胞。在過去十年，明顯的是，細胞身份并不是一成不變的，它能夠通過激活特異性的遺傳程序而得以重寫。如今，再生醫(yī)學領域面臨著一個問題：這種重寫應當采取常規(guī)方法，即成熟細胞首先轉化回干細胞，或者如果可行的話，采取一種更加直接的方法？

術語“終末分化（terminally differentiated）”概述了一種舊的觀念---皮膚細胞、肌肉細胞或其他的成熟細胞不能夠經(jīng)過誘導而獲得一種顯著不同的命運。十年前，這種觀念開始搖搖欲墜，這是因為那年日本京都大學細胞生物學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）證實導入幾個基因能夠?qū)⒊赡甑某衫w維細胞（結締組織）轉化為誘導性多能干細胞（iPS細胞）[1]。類似于胚胎干細胞，iPS細胞能夠分化為任何一種類型的細胞，這一性質(zhì)被稱作為多能性。不同于胚胎干細胞---它們必需從人胚胎中收集，因此面臨著而巨大的政治負擔---的是，iPS細胞也能夠無*地增殖。 

僅僅在山中伸彌的發(fā)現(xiàn)---這一發(fā)現(xiàn)讓他贏取2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎---幾年后，研究人員就已開始發(fā)現(xiàn)改變細胞類型的捷徑，他們稱之為“直接重編程”，即一種類型的成熟細胞經(jīng)誘導后能夠直接變成另一種類型的成熟細胞，而不需要借助產(chǎn)生iPS細胞這一中間階段。研究人員已了解到如何將皮膚細胞轉化為神經(jīng)元或心臟細胞，如何將胃細胞轉化為分泌胰島素的β細胞。利用直接重編程產(chǎn)生神經(jīng)元的德國美因茲古藤堡大學科學家Benedikt Berninger說，“就在你的眼前觀察這些細胞改變它們的身份是非常神奇的。”

相對于對iPS細胞的研究，對直接重編程的研究還處于更加初始的階段，但是它正激發(fā)人們對再生醫(yī)學的興趣。直接重編程的細胞可能比通過iPS細胞中間階段產(chǎn)生的細胞更加安全，這是因為后者可能含有多能性細胞而具有與腫瘤細胞一樣的廣泛增殖能力，這會使得它們潛在地導致癌癥產(chǎn)生。

基于iPS細胞的臨床介入必需謹慎地開展以便確保沒有多能性細胞與*成熟的細胞一起移植。瑞典隆德大學神經(jīng)生物學家Malin Parmar---希望利用直接重編程逆轉帕金森病患者大腦中的神經(jīng)元丟失---說，“風險就是你可能失去對這些細胞的控制，它們在移植后開始不受控制地增殖。但是，如果你繞過iPS細胞產(chǎn)生階段，那么它更加快速和潛在地更加安全。”

改變遺傳程序

重寫細胞身份首先需要理解這些身份是如何建立的。體內(nèi)的每個細胞都能追蹤它的祖先到單個起源：受精卵。當胚胎細胞分裂和成熟時，它們的命運是由發(fā)育過程中特異性的基因開啟和關閉所確定的。被稱作轉錄因子的蛋白首先結合到基因組中的某些DNA序列，隨后激活或抑制附近的基因，從而調(diào)節(jié)這一過程。控制一種發(fā)育中的細胞命運的轉錄因子經(jīng)常被稱作主調(diào)節(jié)因子（master regulator），這是因為它們控制復雜的一連串基因活性。

哈佛干細胞研究所細胞生物學家Qiao Zhou說，“這些主調(diào)節(jié)因子基本上都是根據(jù)它們在胚胎發(fā)生時產(chǎn)生某些細胞類型中的關鍵性作用來決定的。一個祖細胞（progenitor cell）可能能夠變成細胞A、B或C，但是如果你迫使它表達某種主調(diào)節(jié)因子，它將不可避免地選擇變成細胞A。”

證實主調(diào)節(jié)因子能夠用于直接重編程的早期研究可追溯到1987年，那一年，來自弗雷德-哈金森癌癥研究中心的Harold Weintraub、Andrew Lassar和他們的同事們證實誘導成纖維細胞表達某一DNA片段能夠讓它進入變成肌肉細胞的發(fā)育途徑；他們隨后發(fā)現(xiàn)導致這種變化的單個基因編碼轉錄因子MyoD[2]。加州大學舊金山分校格拉斯通心血管疾病研究所心臟發(fā)育研究員Deepak Srivastava說，“這在當時是一項性的發(fā)現(xiàn)，也因此這個領域的人們曾認為大多數(shù)其他類型的細胞會有一種關鍵性的轉錄因子，該因子發(fā)揮如此強大的作用而足以改變細胞的命運。”

但是事情并不是這么簡單。尋找單個能夠啟動重編程的主調(diào)節(jié)因子會導致多年的沮喪，直到山中伸彌揭示出有效重編程的秘密并不是單個因子，而是多種基因的組合。隨著研究人員混合和搭配不同的主調(diào)節(jié)因子組合，成功的故事開始不斷涌現(xiàn)。

2008年，哈佛大學科學家Douglas Melton團隊（Zhou是該團隊的一員）將一種類型的胰腺細胞轉化為另一種產(chǎn)生胰島素的胰腺β細胞，其中β細胞是很多糖尿病患者所需要的。Zhou說，“我們的研究作出結論：你僅需三種主調(diào)節(jié)因子實現(xiàn)這一點。”2010年，斯坦福大學干細胞科學家Marius Wernig領導的一個團隊也利用三種基因?qū)⒊衫w維細胞轉化為神經(jīng)元。對這項研究進一步優(yōu)化和擴展可產(chǎn)生一系列不同的特化神經(jīng)元，其中每種神經(jīng)元產(chǎn)生截然不同的神經(jīng)遞質(zhì)信號，或者對這些不同的信號作出反應。

迄今為止，大多數(shù)開創(chuàng)性的直接重編程發(fā)現(xiàn)都是在體外培養(yǎng)的細胞中實現(xiàn)的。但是若能夠在體內(nèi)促進細胞轉化的話，很多研究人員就會對再生醫(yī)學抱有更加大的希望。在一種器官中相對豐富的細胞群體可能能夠轉化為更加迫切需要的其他類型的成熟細胞。迄今為止，研究人員已在動物實驗中取得一些成就。比如，Parmar團隊發(fā)現(xiàn)通過將攜帶編碼重編程因子的基因的病毒載體注射進小鼠大腦中能夠?qū)⑸窠?jīng)膠質(zhì)細胞轉化為功能性的神經(jīng)元。Srivastava也類似地在心臟內(nèi)將小鼠成纖維細胞轉化為跳動的心肌細胞，這一策略可能提供一種治療心臟病發(fā)作導致的心臟損傷的方法。他說，“你擁有已經(jīng)存在于器官中的大量細胞群體，你能夠?qū)⑺鼈冇糜谠偕?rdquo;但是，迄今為止，還沒有人在人體內(nèi)嘗試過直接重編程。

身份危機

到目前為止，大多數(shù)研究著重關注確保重編程過程成功。鑒于一種細胞類型的身份是由多種基因決定的，研究人員不僅不得不成功地找出啟動這些基因的主調(diào)節(jié)因子組合：理想上，他們也不得不發(fā)現(xiàn)盡可能zui小的組合。這是因為迫使一種細胞表達主調(diào)節(jié)基因（master regulator gene）的zui可靠方法是運送這些基因的額外拷貝到這種細胞中，而相比于運送僅僅幾種基因，運送很多種基因到細胞中是一種更加困難的技術挑戰(zhàn)。找出zui小的主調(diào)節(jié)基因組合需要一番艱苦跋涉：通常，潛在的組合名單是比較巨大的，*的篩選方法就是系統(tǒng)性地逐一測試。比如，Parmar團隊以12種候選基因開展產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元的研究，經(jīng)過一番篩選后，zui終將它縮小到2種基因。

一些研究人員已開始設計專門用于直接重編程的軟件，該軟件整入關于哪些主調(diào)節(jié)因子控制組織形成的信息。一個橫跨三個大洲的團隊已開發(fā)出一種被稱作Mogrify的實驗規(guī)劃工具，這個工具將來自眾多細胞類型的大量基因表達數(shù)據(jù)與不同主調(diào)節(jié)因子控制的基因網(wǎng)絡方面的規(guī)則匯集在一起[4]?；谶@些數(shù)據(jù)和規(guī)則，Mogrify可被用來預測將導致所需的細胞身份變化的重編程因子組合。這就為研究人員提供一種方法在計算上鑒定出盡可能zui少的主調(diào)節(jié)基因組合，這一組合能夠?qū)⒁环N特定類型的細胞直接重編程為另一種特定類型的細胞。

但是提供有活性的主調(diào)節(jié)基因并不足以確保*的重編程：這些主調(diào)節(jié)基因可能成功地將細胞設置在一個發(fā)育途徑上，但是會讓它處于一種未成熟的前體細胞狀態(tài)。因此接下來的任務就是鑒定出其他的哪些基因必須處于活性狀態(tài)來完成這一發(fā)育過程。

中國北京大學干細胞生物學家鄧宏魁（Hongkui Deng）教授多年來努力解決這個問題。他剛開始努力通過只誘導主調(diào)節(jié)基因表達將皮膚細胞直接轉化為肝細胞。在第二輪篩選時，他又鑒定出能夠完成這種重編程的其他基因[5]。他將它們稱為成熟因子（maturation factor），即在啟動轉化時并不發(fā)揮重要作用但在獲得功能性的成熟細胞中起著至關重要作用的基因。

其他研究人員已發(fā)現(xiàn)他們能夠利用在促進重編程的細胞信號通路中發(fā)揮作用的化學物擴大主調(diào)節(jié)基因的效應，從而提高直接重編程的成功效率，有時化學物獨自也能夠促進細胞類型轉換。

即便使用合適的基因和化學衍生物也難以證實一種直接重編程是否是真正完成的。利用顯微鏡進行觀察能夠揭示出一種轉化是否發(fā)生---比如，扁平的星形的成纖維細胞是否形成長長的軸突狀突出，但是也需要對細胞的內(nèi)部運作進行更加深入的分析。簡而言之，一個人如何確保皮膚細胞經(jīng)重編程后是否真正地變成神經(jīng)元，而不只是神經(jīng)元類似物？

檢測主調(diào)控基因的下游活性能夠?qū)毎鼐幊倘绾魏玫爻晒ν瓿商峁┥钊胝J識。如果導入的主調(diào)控基因確實發(fā)揮作用的話，它們應當導致細胞核中的全局基因表達模式發(fā)生重大的變化，那么哪種變化應當匹配在靶組織的成熟細胞中發(fā)現(xiàn)的表達模式呢？有幾種方法研究細胞的全局基因表達，比如，對細胞中的所有RNA分子進行測序。來自波士頓大學和哈佛大學的研究人員已利用這種類型的測序數(shù)據(jù)開發(fā)一種能夠評估重編程細胞中的基因活性如何好地匹配靶基因中的基因活性的軟件程序CellNet[6]。

然而，真正重要的細胞身份測試是重編程細胞是否在功能上能夠替換自然分化的細胞。德州大學西南醫(yī)學中心神經(jīng)生物學家Chun-Li Zhang說，“如果它們看起來像是神經(jīng)元，而且它們的基因表達也類似于神經(jīng)元，那么這并不意味著它們是真正的神經(jīng)元。”令人信服的證據(jù)需要接受一系列評估，比如利用電生理學測量證實一種新形成的神經(jīng)元是否放電，因而是否能夠激活與它通過突觸連接在一起的其他神經(jīng)元。Zhou說，沒有一種特征性的評估方法能夠獨自地提供足夠說服力的證據(jù)。他的團隊將肝細胞重編程為胰腺β細胞的努力只產(chǎn)生功能異常的中間物。他說，“它們合成和釋放大量的胰島素---如此之多以至于動物死于低血糖癥。”這是因為它們?nèi)狈σ认偌毎麢z測血糖水平并對它作出反應的能力。

這些測試的一大發(fā)現(xiàn)是在靶器官內(nèi)促進細胞重編程通常要比在體外培養(yǎng)的細胞中表現(xiàn)得更好。Srivastava說，“當在塑料材料上時，我們細胞中的大多數(shù)經(jīng)過重編程后只是部分地變成心肌細胞。但是在它們的天然環(huán)境中，它們中的絕大多數(shù)進入跳動的狀態(tài)，并且與它們的周圍細胞在電學上偶聯(lián)在一起。”這可能是因為器官中的其他周圍細胞產(chǎn)生的化學信號，或者是因為在三維組織環(huán)境中的特征很難在實驗室中再現(xiàn)。無論出于何種原因，它很好地預示著臨床應用開發(fā)。

通往臨床應用之路

研究人員同意在這些方法能夠在人體內(nèi)測試之前，還有很多障礙要克服。一般而言，已證實相比于小鼠細胞，人細胞在進行直接重編程時更加充滿挑戰(zhàn)：它們傾向于花費更長時間經(jīng)歷這個重編程過程，而且雖然一些轉錄因子足以在動物實驗中實現(xiàn)直接重編程，但是人細胞經(jīng)常需要額外的轉錄因子。

基因轉運也帶來巨大的挑戰(zhàn)，特別是將基因轉運進大腦等器官中。在一些情形下，偏好感染特定細胞類型的病毒能夠有助引導重編程因子進入特定的患病或損傷位點，但是運送到不需要的位點可能仍然會帶來風險。

不過，還會存在拆了東墻補西墻的問題。在大腦中，將神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉化為神經(jīng)元會降低那里的神經(jīng)膠質(zhì)細胞數(shù)量，而這本身可能就產(chǎn)生風險。Berninger說，“這些細胞不是裝飾門面。它們也發(fā)揮重要的功能，但是如果我們把它們拿走了，我們該如何替換它們呢？”一種可能性就是細胞在經(jīng)重編程后進入一種增殖性的---但非致瘤性的---神經(jīng)祖細胞（neural progenitor）狀態(tài)。那樣的話，一些神經(jīng)膠質(zhì)細胞可能能夠產(chǎn)生大量的神經(jīng)元。

心臟治療很可能zui接近于臨床應用。Srivastava團隊已開始研究將豬心臟內(nèi)的成纖維細胞轉化為心肌細胞。他說，“我們有初步的概念驗證：即便在像我們這樣的大的心臟中，我們也能夠?qū)崿F(xiàn)轉化的效果。”如今，這個團隊正在開展安全性研究，而且正在優(yōu)化他們的基因運送方法，以便實現(xiàn)獲得監(jiān)管部門批準用于人體臨床試驗的目標。重要的是，心臟成纖維細胞能夠自我補充，因此對細胞丟失的擔憂并不那么嚴重。

Zhou團隊努力將體外培養(yǎng)的人胃腸道細胞直接轉化為β細胞，并且也正在努力在診所中開展應用。這些腸道細胞很容易通過活組織檢查獲得，而且在體外培養(yǎng)和重編程后，在理論上，它們能夠移植到患有糖尿病的志愿者的胰腺中。

直接重編程正開始獲得產(chǎn)業(yè)界的關注，不過生物技術公司和制藥公司并沒有準備好全心全意地投入其中。盡管從某種意義上說，對iPS細胞和胚胎干細胞的研究有先行一步的優(yōu)勢，但是隨著細胞類型直接轉化的優(yōu)勢日益突出，這一差距可能會被填平。Zhou說，“迄今為止，還沒有同等數(shù)量的資源和人力投入到這種方法中。但是這個領域正在快速趕上，我迫不及待地想看到它將會如何發(fā)展。