聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為分子生物學(xué)研究的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析的方法。該項技術(shù)可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術(shù)的特異性和準(zhǔn)確性，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病診斷、農(nóng)業(yè)檢測和法醫(yī)調(diào)查等領(lǐng)域。
一、常規(guī)PCR
利用DNA分子會在體外95°高溫時會發(fā)生變性解旋變成單鏈，然后降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，如此循環(huán)往復(fù)以達(dá)到DNA分子擴(kuò)增的目的，常規(guī)PCR技術(shù)無法實現(xiàn)精確定量。
二、實時熒光定量PCR
如要對DNA、RNA樣品進(jìn)行精確定量研究，就需要采用實時熒光定量PCR，根據(jù)檢測實時熒光PCR產(chǎn)物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結(jié)合染料法、基于探針的化學(xué)法、淬滅染料引物法等類型。
1.DNA結(jié)合染料法
原理：應(yīng)用一種帶有熒光的、非特異的DNA結(jié)合染料檢測PCR過程中積累的擴(kuò)增產(chǎn)物。
應(yīng)用于核算定量和基因表達(dá)驗證。
優(yōu)缺點：它們的優(yōu)點是可以對任何雙鏈DNA進(jìn)行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，并且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應(yīng)中結(jié)合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產(chǎn)生的引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結(jié)合的熒光染料，不會與單鏈DNA結(jié)合，并且在游離狀態(tài)下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結(jié)合才會發(fā)出熒光，因此將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA數(shù)量與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生實時監(jiān)測的效果。
2.基于探針的化學(xué)法
原理：應(yīng)用一個或多個熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。
優(yōu)缺點：探針法的鑒別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于DNA結(jié)合染料法，因為它們只與目的產(chǎn)物結(jié)合，從不與引物二聚體或其他非特異產(chǎn)物結(jié)合，缺點是它的合成價格高。
探針法中常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，而淬滅基團(tuán)則在3’末端，PCR擴(kuò)增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，PCR擴(kuò)增時，5’→3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而檢測器可以接收到熒光信號。
3.淬滅染料引物法
原理：采用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增，從而使熒光標(biāo)記基團(tuán)直接摻入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，依賴熒光能量共振傳遞。
應(yīng)用于核酸定量、基因表達(dá)驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR
優(yōu)缺點：探針和目標(biāo)片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，缺點是原料成本價格高
三、實時熒光PCR儀
實時熒光PCR系統(tǒng)包括熱循環(huán)儀，用于熒光激發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)以及用于收集熒光數(shù)據(jù)和管理分析的計算機(jī)軟件，數(shù)據(jù)通過實時分析軟件以圖表的形式顯示。
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