放線菌（Actinomycetes）是一種原核生物類群，在自然界中分布很廣，是一類極其重要的微生物資源，與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，突出的特性就是能產(chǎn)生大量的、種類繁多的抗生素。放線菌能形成分枝菌絲和分生孢子，呈菌絲狀生長(zhǎng)，主要通過形成無(wú)性孢子的方式進(jìn)行繁殖，也可借菌體分裂片段繁殖。放線菌長(zhǎng)到一定階段，一部分氣生菌絲形成孢子絲，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱為分生孢子。
圖1 放線菌模式圖
圖2 放線菌的氣生菌絲和孢子絲
由于孢子因其體積小、質(zhì)輕、易飄散等特點(diǎn)，極易造成同一固體平板上的不同單克隆菌落間產(chǎn)生交叉污染問題，給放線菌的培養(yǎng)和分離帶來了巨大挑戰(zhàn)。
天木生物的高通量微升級(jí)液滴培養(yǎng)組學(xué)系統(tǒng)——MISS cell，可將細(xì)胞(孢子)包裹于液滴中，形成獨(dú)立的培養(yǎng)單元，避免菌絲或孢子飛散至其它液滴單克隆內(nèi)，從而克服菌株間的交叉污染問題，提高獲得放線菌單克隆的效率和純度。本實(shí)驗(yàn)基于菌絲體實(shí)現(xiàn)放線菌的分離與培養(yǎng)，為不產(chǎn)孢子的絲狀菌的分離培養(yǎng)提供一種分離培養(yǎng)方法。
二、使用MISS cell分離培養(yǎng)放線菌
1.樣品預(yù)處理，確定上機(jī)濃度
收集放線菌菌絲體（30℃，培養(yǎng)4天），加入玻璃株打碎菌絲過濾，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用BM培養(yǎng)基將樣品濃度稀釋至500-1000 CFU/mL，工作流程如下：
圖3 樣本處理工作流程
2.MISS cell分離培養(yǎng)
本實(shí)驗(yàn)共生成2500個(gè)液滴，培養(yǎng)96h后進(jìn)行檢測(cè)及分選，經(jīng)過60分鐘的分選，共得到含菌液滴約500個(gè)，MISS cell儀器工作流程如下圖所示。
圖4 MISS cell工作流程
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1）生長(zhǎng)速率對(duì)比：不同時(shí)間點(diǎn)觀察液滴及平板放線菌生長(zhǎng)情況，液滴培養(yǎng)1天后液滴中出現(xiàn)生長(zhǎng)，平板培養(yǎng)6天后出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)，液滴培養(yǎng)放線菌生長(zhǎng)速率顯著優(yōu)于平板培養(yǎng)，放線菌的最佳培養(yǎng)分選時(shí)間為4天。
圖5 放線菌在固體平板上的生長(zhǎng)情況
圖6 放線菌在液滴中的生長(zhǎng)情況
圖7 放線菌培養(yǎng)4天，在OD模式下的分選情況
圖8 放線菌培養(yǎng)4天，在熒光模式下的分選情況
三、天木生物MISS cell儀器為放線菌的分離、培養(yǎng)和篩選過程提供高通量、高效自動(dòng)化解決方案
本研究中使用天木生物的MISS cell儀器，共生成2500個(gè)液滴，分選得到單菌落約500個(gè)，實(shí)現(xiàn)放線菌自動(dòng)化培養(yǎng)和分選，有效避免了菌株之間的交叉污染。同時(shí)，對(duì)于不產(chǎn)孢子的絲狀菌也提供了一種分離培養(yǎng)方法。本次實(shí)驗(yàn)共計(jì)消耗培養(yǎng)基8ml，全程自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)液滴生成、培養(yǎng)和篩選至96孔板中，大幅提升單克隆獲取效率，同時(shí)有效避免交叉污染問題，為放線菌的單克隆篩選提供了高效工具平臺(tái)。
天木生物MISS cell儀器為包括放線菌在內(nèi)含孢子的細(xì)菌，提供了單克隆培養(yǎng)和高通量篩選的高效自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，為菌株的培養(yǎng)和篩選提供強(qiáng)力支持！
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