上期回顧

中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康研究所、寧波大學(xué)食品與藥學(xué)院中國食品科學(xué)與技術(shù)系、島津企業(yè)管理(中國)有限公司聯(lián)合研究，成功建立并驗證了適用于血清中多種維生素D代謝物的高通量、高靈敏度SFC-MS/MS分析方法。

上期介紹了研發(fā)背景及如何建立并優(yōu)化色譜條件等研究內(nèi)容。

本期將介紹對已建立的SFC-MS/MS方法進行驗證 、并與LC-MS/MS法比較等研究成果。

文章出處

Journal of Chromatography B 1120 (2019) 16-23

島津Nexera UC全相系統(tǒng)之SFC-MS系統(tǒng)

本研究采用島津超臨界流體色譜儀Nexera UC、島津三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀LCMS-8060

● 超臨界流體與改性劑配合使用，可在更大范圍內(nèi)滿足不同極性化合物的檢測需要；

● 低死體積和背壓控制單元有效降低脈動，提高靈敏度；

● 溶劑使用量少且分析時間短，是一種綠色環(huán)保、高效的分析手段。

SFC-MS/MS方法驗證

驗證項目有：拖尾因子(TF)、保留時間RSD、峰面積RSD、標準曲線線性、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

表1 SFC-MS/MS的方法驗證結(jié)果

此外，還對準確度和精密度進行了評估。如表2所示，QC和NIST樣品的準確度均＜5.5%。日內(nèi)和日間精密度的RSD值分別在0.52-7.93%和1.35-9.04%之間，表明SFC-MS/MS性能偏差在可接受范圍內(nèi)。

表2 QC和NIST樣品的準確度和精密度（日內(nèi)和日間）

SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法的比較

將驗證過的SFC-MS/MS方法與同一色譜柱內(nèi)部開發(fā)的參考LC-MS/MS方法進行比較。SFC在10 min內(nèi)實現(xiàn)分析物的基線分離，而LC系統(tǒng)則需要16分鐘以上才能實現(xiàn)等質(zhì)量的分析物的相似分離度。此外，與LC-MS/MS相比，SFC-MS/MS具有更低信噪比獲得較低的LOQ。

表3 比較SFC-MS/MS和LC-MS/MS法對VD代謝物的保留時間、信噪比(S/N)、定量限(LOQ)和峰分離度(USP)的影響。

為考察SFC-MS/MS法對實際樣品分析的準確度，對46份未加標的人血清樣品進行分析，以評估該法與LC-MS/MS方法相比的潛在偏差。如圖1，SFC-MS/MS法與LC-MS/MS法回歸相關(guān)性顯著，VD₂/VD₃、25-OH VD₂/VD₃、3-epi-25-OH VD₂/VD₃和24,25-(OH)₂ VD₃分別為R2≥0.98和P≤0.001。Bland-Altman圖表明，兩種方法之間不存在濃度依賴的差異。方法間的測量值對LC-MS/MS測量值的平均差異偏差為-0.9% ~ 2.7%。

圖1. SFC-MS/MS和LC-MS/MS方法的回歸分析和Bland-Altman

結(jié)論

本研究開發(fā)并驗證了SFC-MS/MS方法作為同時測定人血清中VD代謝物的替代方法。不同VD代謝物在SFC和LC體系中洗脫能力也有差異。并且SFC有效改善等質(zhì)量分析物的分離，比LC具有更短的保留時間和更高的靈敏度。與反相LC相比，超臨界CO2更環(huán)保，有機溶劑消耗更少。因此，采用SFCMS/MS方法可以在高通量的情況下對VD代謝產(chǎn)物進行準確、精確的分析。建立的SFC-MS/MS方法與參考的LC-MS/MS方法對人血清中VD代謝物ng/mL水平的定量一致，兩種方法之間不存在濃度依賴性差異。然而，對于痕量(pg/mL)的VD代謝物，如1,25-(OH) VD2/VD3，還需要未來開發(fā)出更高靈敏度的質(zhì)譜儀來分析。

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