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產品描述
Evagreen是一種用于實時定量PCR（qPCR）的DNA 結合染料。該染料的諸多優(yōu)點使它遠勝于SYBR Green I。除了有相似的光譜特性，本產品有三個主要特點使它區(qū)別于SYBR Green I 。
首先，本產品對PCR的抑制性遠小于SYBR Green I。因此，使用本產品進行的qPCR實驗可以使用快速PCR步驟。同時，本產品在實驗中可以使用較高的濃度，從而獲得遠強于SYBR Green I擴增信號。較高濃度的本產品也消除了“染料重分布"的缺陷，使本產品既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲線分析（HRM）。該分析正被越來越多的用于PCR后的基因分型和異源雙鏈分析。由于SYBR Green I對PCR的抑制性，從而要求其使用濃度必須很低，因此SYBR Green I無法解決由低濃度造成的染料重分布問題，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同時，染料重分布問題也可能影響常規(guī)熔解曲線的可靠性，因為低熔點的DNA鏈可能由于這種原因而無法檢測到。
第二，本產品的穩(wěn)定性*。在正常的儲存、操作和PCR過程中不會被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲存在室溫或冰箱里，也可以反復凍融。與之相反，SYBR Green I不穩(wěn)定而且降解后對PCR抑制性更強。
第三，本產品降低了細胞膜透性，因而比SYBR Green 1更加安全。獨立實驗室的測試結果顯示，本產品既沒有誘變性也沒有細胞毒性。相反，雖然SYBR Green I本身誘變性很弱，但它在細胞中可能抑制了正常DNA的修復機制，使其有誘變增強作用?？紤]到PCR的廣泛使用，其安全性應該足夠重視。
訂購信息
| 貨號 | 規(guī)格 |
| AN19L032 | 1 mL |
| AN19L033 | 5 mL |
產品參數
λabs/λem = 500/530 nm (結合DNA)
λabs = 471 nm (未結合DNA)
保存方法
4℃或-20℃，避光保存，有效期見外包裝。
操作步驟
如下建立實驗體系：（僅供參考）
| 名 稱 | 體 積 |
| 10× 的無Mg2＋聚合酶緩沖液 | 5 µL |
| 50 mM MgCl2 | 2.5 µL |
| 2 mM dNTP | 5 µL |
| 20×evagreen | 2.5 µL |
| Taq DNA polymerase | 1-5 units |
| F, R Primers | 各0.1-0.5 µM |
| 模板 | 適量 |
| dH2O | to a final volume of 50 µL |
實驗目的
實時定量PCR檢測20×evagreen
主要試劑
1. Prime
hβ-actin：
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)
實驗方案
1. 配制2×evagreen Buffer
| 2×evagreen Buffer | ||
| 組分 | 濃度 | 體積（μL） |
| 1 M Tris HCl pH8.5 | 50 mM | 5 |
| 500 mM (NH4)2SO4 | 20 mM | 4 |
| 50 mM MgCl2 | 7 mM | 14 |
| 50% glycerol | 2.5% | 5 |
| DMSO | 10 % | 10 |
| 20×evagreen | 2× | 10 |
| 10 mM dNTPs | 0.4 mM | 4 |
| 2 % Tween20 | 0.03 % | 1.5 |
| 1 mg/mL BSA | 22 mg/mL | 2.2 |
| H2O | / | 44.3 |
| Total volume | / | 100 |
2. 配制 q-PCR反應體系
| 成分 | 20 μL/體系/管反應 |
| 10 μM primers | 1 μL |
| 模板 | 適量 |
| HS Taq DNA 酶 （5 U/μL） | 0.2 μL |
| 2×evagreen buffer | 10 μL |
| H2O | 定容至20 μL |
【注】：① DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同種類的 DNA模板中含有的靶基因的拷貝數不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的 DNA 模板添加量。cDNA作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應液總體積的 10%。②引物終濃度一般控制在0.1-0.5 μM范圍內。
3. 實驗分組：標準對照樣品孔（陽性對照）、檢測樣品孔、空白對照孔（陰性對照）共三組，同時進行檢測，分別進行三次平行實驗。
4. 混勻離心、上機進行熒光定量PCR（儀器為Roche：LC96）。
PCR程序：
| 溫度 | 時間 | |
| Step 1 | 95 ℃ | 2 min |
| Step 2 | 95 ℃ | 5 sec |
| Step 3 | 60 ℃ | 30 sec |
| Step 2~3，重復 45個循環(huán) | ||
| 熔解曲線Tm值 57 ℃~99 ℃ | ||
5. 保存數據，判斷樣本質量：
A．檢測樣品與標準品之間的Ct值差
B．檢測樣品與標準品之間的熒光強度差
檢測結果需達到：以上兩組檢測指標無顯著性差異
產品圖片
注意事項
該產品*于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。
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LyGreen (20×in water) HRM用染料（20×水溶液）（貨號：AN19L022）
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