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原代細(xì)胞培養(yǎng)過程可能出現(xiàn)的問題及解決辦法

時(shí)間:2017/6/8閱讀:6984
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原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問題,客戶遇到的問題從細(xì)胞生長角度來說,針對(duì)細(xì)胞不貼壁、生長緩慢、生長不好,甚至死亡的原因,我們做以下分析并提出相對(duì)應(yīng)的解決方法。
一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁
可能原因: 
●胰蛋白酶消化過度 
●支原體污染 
●培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解)               
●細(xì)胞老化 
●接種細(xì)胞起始濃度太低或太高 
解決方法: 
●縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度 
●分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。 
●使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2 
●啟用新的保種細(xì)胞 
●調(diào)節(jié)*接種細(xì)胞濃度
二、懸浮細(xì)胞成簇
可能原因: 
●培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子; 
●支原體污染; 
●蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解; 
●DNA污染 
解決方法: 
●用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞,輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液; 
●分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體; 
●用DNaseI處理細(xì)胞
三、培養(yǎng)原代細(xì)胞生長緩慢
可能原因:
●由于更換不同培養(yǎng)液或血清; 
●培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞; 
●培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染; 
●試劑保存不當(dāng); 
●接種細(xì)胞起始濃度太低; 
●細(xì)胞已老化; 
●支原體污染 
解決方法: 
●比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分,比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn),讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液; 
●換入新鮮配置培養(yǎng)液,或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子;
●用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,丟棄培養(yǎng)物;
●血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存,需在1周內(nèi)用完;
●增加接種細(xì)胞起始濃度; 
●換用新的保種細(xì)胞; 
●分離培養(yǎng)物,檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。
四、培養(yǎng)細(xì)胞生長不好
可能原因:
●細(xì)胞本身的狀態(tài)
細(xì)胞傳代次數(shù)多,細(xì)胞老化;
細(xì)胞的接種量:接種量過低,細(xì)胞生長緩慢;
細(xì)胞傳代時(shí)間過晚:細(xì)胞中毒,影響傳代后的細(xì)胞生長;
胰酶消化時(shí)間過長或過短:時(shí)間過長,細(xì)胞死亡;時(shí)間過短,細(xì)胞未*分離而成團(tuán),細(xì)胞死亡;
細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇:慢凍速融。
●污染
支原體污染
霉菌污染
●培養(yǎng)基或血清
更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證
選擇的培養(yǎng)基是否合適
培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤
原代細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境
CO2供應(yīng)是否正常
培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確

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