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細胞懸液標本制備實驗步驟

時間:2017/6/27閱讀:3270
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細胞系懸液標本制備實驗步驟

(1)取材:收集對數生長期細胞于離心管中,800~1000r/min離心10min,棄上清,彈指法混勻細胞。沿管壁加入2.0%~2.5%冷戊二醛,輕輕吹打,4℃固定30min。用小鋁片將細清。4℃PBS緩沖液沖洗1~2h或過夜,1000r/min離心5min,棄上清。

(2)制備預包埋塊:管內加入2%~4%37℃瓊脂糖液0.1~0.5ml,兩手搓離心管,使細胞系與瓊脂糖混勻,室溫冷卻,形成細胞瓊脂凝膠預包埋塊。離心管內加適量PBs緩沖液或75%乙醇溶液,鋁片沿管輕輕地將細胞瓊脂糖凝膠塊松動,預包埋塊移入含75%乙醇溶液的青霉素瓶內,24h后換固定液一次,4℃保存,1年內使用。

(3)固定:預包埋塊切成1mm3大小,置1%鋨酸4℃固定1~2h。

(4)漂洗與脫水:PBS緩沖液反復漂洗30min或過夜。分別用50%、70%、90%、100%丙酮脫水各1次,每次10~15min;100%丙酮脫水3次,每次30min。

(5)浸透、包埋與聚合:浸入稀釋包埋劑(丙酮:包埋劑為1:1)中,室溫1h。再浸入純包埋劑(如環(huán)氧樹脂)中,37℃過夜。60℃固化48h。干燥器內保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)超薄切片:首先將標本包埋塊頂端修成近45。的四邊錐體,使標本暴露出來,切面呈長寬約為0.4mm~0. 6mm的長方形或梯形。然后將其夾在標本夾中,固定在切片機上。玻璃切片刀需用膠布圍成水槽,加入適量蒸餾水,使切下的薄片漂在水面,用覆有支持膜(透明塑膠膜)的載網(銅網或鎳網)收集。可以根據薄片與水面反射光所產生的干涉色判斷切片的厚度:以銀白色(50~70nm)為*;薄片大于l00nm(紫紅色),電子束的穿透較差,微細結構辨別不清;但小于40nm(暗灰色)圖像反差低,難以觀察。

(7)染色:在平皿中放一片蠟紙,并在其上滴1滴乙酸鈾染液,用彎頭小鑷子夾住載網邊緣,把貼有薄片的一面朝下,輕輕插入染液中,蓋上平皿蓋,室溫下染色10~20min,雙蒸水清洗2次;置人枸櫞酸鉛染液中染色15min,0. 1mol/L NaOH染液漂洗1~2s,雙蒸水清洗2次。

(8)觀察:切片自然干燥后觀察。

細胞系注意事項

(1)鋨酸揮發(fā)性強,有強烈的刺激性氣味且毒性強,易蒸發(fā),對皮膚、呼吸道黏膜及眼睛角膜有傷害作用,因此操作時應在通風櫥中進行。配制和儲存不當會產生鋨黑,使其失效,因此需冷凍、密封和避光保存,臨用前需*化開,以免濃度欠佳。

(2)玻璃切片刀現用現做,通常一把刀切一個標本。

(3)乙酸鈾染液有微量放射性,能發(fā)熒光,需小心使用、避光保存。染色時應避免強光直射,避免污染皮膚和實驗臺面。

(4)染色時要注意染液的濃度、pH和染色時間等必要條件,使染色的同時不會掩蓋精細結構的層次。

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