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原代細胞復蘇技術

時間:2017/7/6閱讀:581
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1. 原代細胞凍存復蘇技術簡介
在ELISPOT檢測的應用中,往往需要用到凍存的淋巴細胞樣品作為檢測細胞。由于ELISPOT檢測的是細胞的免疫功能,不僅僅需要保持細胞的存活率,而且還要保證細胞的功能不發(fā)生變化。傳統(tǒng)的細胞凍存方法通常是為了保存細胞株,對細胞存活率的要求不高,更沒考慮保持細胞原有的免疫狀態(tài),所以傳統(tǒng)的細胞凍存方法已經(jīng)不能滿足ELISPOT檢測的要求。參見圖7.1。
考慮到ELISPOT檢測的特殊性,荷蘭U-CyTech公司經(jīng)過精心的研究與反復的驗證,推出了Cryostar™凍存試劑盒,在凍存液中添加了一系列對細胞有特殊保護作用的保護劑。達科為公司在接到Cryostar™凍存試劑盒之后,在我們的實驗室以及國內(nèi)數(shù)家客戶的實驗室做了細胞凍存與復蘇的實驗,并且對復蘇之后的細胞做了ELISPOT檢測。結(jié)果表明,淋巴細胞的存活率超過90%,ELISPOT斑點形成頻率與新鮮細胞*相同。
2. 細胞凍存、復蘇的標準程序
l 實驗儀器:
    ² 可控溫度細胞離心機離心機;
    ² 血球計數(shù)板或者自動細胞計數(shù)設備; 
    ² 細胞程序降溫盒Nalgene “Mr. Frosty”;
    ² -70°C冰箱;
    ² 液氮罐;
    ² 37°C水浴鍋。
l 耗材準備
    ² 15ml圓錐底聚丙烯(PP)離心管; 
    ² 無菌的原代細胞凍存管,2ml,外螺旋;
l 試劑配制
    ² 熱失活補體胎牛血清; 
    ² R0培養(yǎng)基:RPMI-1640培養(yǎng)基,含谷氨酰胺,加入1%雙抗,不加血清。
    ² 達優(yōu)®無血清培養(yǎng)基:已經(jīng)含有谷氨酰胺和雙抗,打開即用。
    ² Cryostar™重懸液(Cryostar™ Resuspension Medium):含有細胞凍存保護成分,-20°C長期保存,4°C可以保存6個月。
    ² Cryostar™ 2×凍存液(Cryostar™ Freezing Medium):含有原代細胞凍存保護成分以及DMSO,-20°C長期保存,4°C可以保存6個月。

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