非酶消化法實驗原理

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非酶消化法(EDTA消化法)

EDTA是一種非酶消化物，又稱螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好，該化學物質(zhì)能與細胞上的鈣、鎂離子結合形成螯合物，利用結合后的機械力使細胞變圓而分散細胞或使貼壁細胞從瓶壁上脫離，缺點是細胞易裂解或貼壁細胞從瓶壁上脫離時呈片狀，有團塊，常不單獨使用，但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1)，不僅利于細胞脫壁又利于細胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。

消化分離法的操作步驟：

(1)剪切把組織塊剪碎，呈1~5mm3大小的組織塊。

(2) 加液漂洗將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜，自然沉降法)。

(3)消化加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當時間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時間不宜過長。

(4)棄去消化液采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。

(5)漂洗將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培養(yǎng)基。

(6)機械分散采用吸管吹打或振蕩法，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無菌紗布過濾后分瓶培養(yǎng)，若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘，吸上層細胞懸液進行分瓶培養(yǎng)。

注意事項如下：

(1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

(2)胰蛋白濃度不宜過高，作用時間不能太長，以避免毒性作用。

(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液，以避免毒性產(chǎn)生，而且動作要輕，以避免膨松的細胞隨漂洗而丟失。

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非酶消化法實驗原理

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