(一) 準(zhǔn)備和安裝濾器

在超凈工作臺內(nèi)打開包有清洗滅菌好的過濾器的牛皮紙，并架好。膠管一段接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管伸入到已消毒的瓶子中。用濾泵做正壓過濾，壓力數(shù)字為2。過濾后檢查濾膜是否完好無損。

(二) 合成培養(yǎng)基的配制

1、 取3000ml三蒸水，加入合成培養(yǎng)基干粉，用磁力攪拌一定時間(2-4h)使之充分溶解。

2、 通入適量CO2 或加入6mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0左右。

3、 加入一定量的NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0左右。

4、 加水至zui終體積。

5、 在超凈工作臺中對溶液進(jìn)行過濾除菌，分裝入250ml或500ml培養(yǎng)瓶中，用翻冒塞塞緊瓶口。

6、 4℃冰箱儲存(可以-20℃儲存)。

(三) 小牛血清的處理

市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還要做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補(bǔ)體。

1、 將血清加熱到56℃并保存30min，期間要不時的輕輕搖晃，使受熱均勻，防止沉淀析出;

2、 處理后的血清儲存于4℃;

3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

(四) 生長培養(yǎng)基的配制

除無血清培養(yǎng)之外，各種合成培養(yǎng)基在使用前需要加入一定量的小牛血清和抗生素。

1、培養(yǎng)基分裝成小瓶(100ml-200ml)以便使用，翻冒塞塞緊瓶蓋;

2、按以下比例配制：

基本培養(yǎng)基占80%-90%，小牛血清占10%-20%。

按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使用青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/ml和100μg/ml。

五、 注意事項

1、 培養(yǎng)細(xì)胞使用的瓶子和飯盒應(yīng)與提取RNA和培養(yǎng)細(xì)菌的瓶子和飯盒嚴(yán)格分開。因為用于處理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一種致癌物，可能影響細(xì)胞生長;而培養(yǎng)過細(xì)菌的用品也不應(yīng)與細(xì)胞混用。

2、 過濾時壓力不可過大，否則細(xì)菌易濾過達(dá)不到除菌效果，或使濾膜破裂。分裝時需根據(jù)使用量的多少選擇合適大小的瓶子，并且每瓶只能裝2/3體積的液體，過多時瓶子易爆或膠塞自噴。

3、 濾器用畢立即刷洗，過蒸餾水，晾干收藏。