1如何進(jìn)行人表皮角質(zhì)形成原代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)？
問＆答-------------------------------------------
皮膚不但是人體的生理屏障，而且在機(jī)體免疫和內(nèi)分泌等方面起著極其重要的作用。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞的主要組成部分，角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)可為皮膚毒理學(xué)、燒傷治療學(xué)、美容學(xué)和皮膚病發(fā)病機(jī)制的研究提供新的途徑。那么該如何進(jìn)行人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的傳代培養(yǎng)？
1.達(dá)到60%～75%的融合后，移去培養(yǎng)基，單層細(xì)胞使用10ml 1：5000乙二胺四乙酸(Versene)沖洗。1～2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培養(yǎng)瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分鐘。當(dāng)細(xì)胞開始變圓時(shí)，移除胰蛋白酶，在36°C ± 2°C再次孵育。
2.當(dāng)大約90%細(xì)胞分離時(shí)，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶活性。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml無(wú)菌離心管，在室溫下40g離心5分鐘。細(xì)胞重新制成懸液并按上述方法再次離心。
3.角質(zhì)形成細(xì)胞使用3～5ml*培養(yǎng)基輕柔的吹打成懸液，細(xì)胞大約1～3×106 放入75cm2組織培養(yǎng)瓶中，并加入15ml*培養(yǎng)基。
4.細(xì)胞培養(yǎng)： 36°C ± 2°C，5% CO2的空氣中。角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液約每2～3天更換一次，當(dāng)達(dá)到60%～75%融合后，即可進(jìn)行傳代。

2進(jìn)行細(xì)胞凍存時(shí)，該注意些什么？
問＆答-------------------------------------------
細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。目前，細(xì)胞凍存zui常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法。其方法是將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣只要在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞就可用于實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行細(xì)胞凍存時(shí)，該注意些什么？
(1)原代細(xì)胞在冷凍過(guò)程中在-20℃冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過(guò)1 小時(shí)，以防止冰晶過(guò)大而破壞細(xì)胞。也可跳過(guò)-20℃這一步驟直接放入-80℃冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要低一些。
(2)DMSO稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。
(3)DMSO必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的。新買的DMSO 本身處于無(wú)菌狀態(tài)，*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管或瓶中，4℃保存。避免反復(fù)凍融造成DMSO 裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。并可減少污染機(jī)會(huì)。如要過(guò)濾DMSO，必須選用耐DMSO 的尼龍濾膜(millipore)。細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)液，血清或蛋白。

3細(xì)菌、支原體等微生物污染在細(xì)胞培養(yǎng)中有哪些特點(diǎn)？
問＆答-------------------------------------------
細(xì)胞培養(yǎng)中的微生物污染種類可分成細(xì)菌、支原體、真菌和病毒污染。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之胎牛血清和污染之細(xì)胞等。細(xì)菌、支原體等微生物污染在細(xì)胞培養(yǎng)中有哪些特點(diǎn)？
1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響明顯。
2、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國(guó)內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過(guò)濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死掉。
3、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長(zhǎng)出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。
4、病毒：組織細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
那么確定細(xì)胞受到哪種微生物污染之后，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過(guò)濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對(duì)一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在原代細(xì)胞使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。