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逆轉(zhuǎn)錄酶怎么選？
逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)是一種用于從RNA模板生成互補DNA(cDNA)的酶，是cDNA合成和RT-qPCR反應(yīng)中的核心酶，其合成的cDNA可以直接作為PCR,qPCR，LAMP和測序等檢測的模板。那么你知道該如何選擇逆轉(zhuǎn)錄酶嗎？讓我們一起來看看吧！
一、逆轉(zhuǎn)錄酶活性
逆轉(zhuǎn)錄酶主要包括以下三種活性：
?、倌孓D(zhuǎn)錄活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA雜合雙鏈。
?、赗Nase H活性：水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補的DNA單鏈（cDNA）。
?、跠NA指導的DNA聚合酶活性：以cDNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成雙鏈DNA。
二、決定最佳逆轉(zhuǎn)錄酶的幾個關(guān)鍵重要特性
1.熱穩(wěn)定性
耐高溫能力是cDNA合成的一個重要方面，因為高溫有助于使具有強二級結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性，從而實現(xiàn)全長cDNA合成和更高產(chǎn)量。
野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在37°C下表現(xiàn)最佳，而加工改造后的熱穩(wěn)定性MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可以承受高達55°C的溫度，而不會對逆轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生負面影響。
2.RNase H活性
RNase H(核糖核酸酶H)是一種切割并降解RNA-DNA雜交鏈中RNA鏈的酶，同時可以保持DNA鏈的完整。
如果逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性過高，則會導致RNA模板的過度降解，引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶可以最大限度地減少反應(yīng)中RNA分子的非特異性降解，提高cDNA合成的特異性和保真度。
由于RNA模板在全長逆轉(zhuǎn)錄完成之前可能被降解，RNase H活性是長片段cDNA合成過程中需要規(guī)避的因素。RNase H活性還可能會與逆轉(zhuǎn)錄酶中的活性聚合酶競爭從而降低逆轉(zhuǎn)錄效率。為了更好地合成cDNA，通過在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域中引入突變，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性降低甚至完q消除。這種突變常常可以增加長鏈cDNAs的產(chǎn)量，促進其合成。
3.持續(xù)合成能力
持續(xù)合成能力是指在酶的單個結(jié)合事件中摻入的核苷酸數(shù)量。持續(xù)合成能力強的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在更短的反應(yīng)時間內(nèi)合成更長的cDNA鏈。大多數(shù)經(jīng)過改造的逆轉(zhuǎn)錄酶具有更強的合成能力(比野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶高65倍)。
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