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上海欣中生物工程有限公司

血液基因組DNA中提試劑盒的操作步驟描述

時間:2025-4-10 閱讀:481
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   以下是血液基因組DNA中提試劑盒更詳細的操作步驟描述,以常見的基于硅膠膜吸附柱的試劑盒為例:

一、實驗前準備

  1. 試劑與耗材
    • 檢查試劑盒組分:裂解液(Buffer AL/BL)、洗滌液(Buffer AW1/AW2)、洗脫液(Buffer AE)、蛋白酶K、吸附柱、收集管等。
    • 自備物品:無水乙醇(如需添加到洗滌液中)、離心機、移液器、1.5mL離心管、渦旋振蕩器、水浴鍋(或金屬浴)。
  2. 樣本處理
    • 使用EDTA抗凝全血,確保樣本未溶血。若樣本量不足,可用生理鹽水或PBS稀釋至推薦體積(如200-500μL)。

二、詳細操作步驟

步驟1:紅細胞裂解(可選,視試劑盒設計而定)

  • 目的:去除紅細胞,保留白細胞核。
  • 操作
    1. 將全血樣本轉移至15mL離心管,加入3-5倍體積的紅細胞裂解液(如Buffer EL)。
    2. 顛倒混勻后,室溫靜置5-10分鐘,期間輕彈管底以促進裂解。
    3. 2000×g離心5分鐘,棄上清(含裂解的紅細胞)。
    4. 重復上述步驟直至沉淀呈白色(白細胞團塊)。

步驟2:細胞裂解與DNA釋放

  • 目的:裂解白細胞,釋放基因組DNA。
  • 操作
    1. 向白細胞沉淀中加入200μL Buffer AL(含蛋白酶K),渦旋振蕩15秒。
    2. 56℃水浴孵育10-30分鐘(或根據試劑盒要求),期間每隔5分鐘渦旋一次。
    3. 孵育后短暫離心,使管蓋液體回落。

步驟3:DNA結合至吸附柱

  • 目的:將DNA吸附到硅膠膜上。
  • 操作
    1. 向裂解液中加入200μL無水乙醇,渦旋混勻(若試劑盒已預加乙醇,則跳過此步)。
    2. 將混合液轉移至吸附柱(置于2mL收集管中),8000×g離心1分鐘。
    3. 棄收集管中廢液,將吸附柱放回原收集管。

步驟4:洗滌純化DNA

  • 目的:去除蛋白質、鹽分等雜質。
  • 操作
    1. 向吸附柱中加入500μL Buffer AW1,8000×g離心1分鐘,棄廢液。
    2. 加入500μL Buffer AW2(含乙醇),14000×g離心3分鐘,去除殘留乙醇。
    3. 重復離心一次(空管),確保吸附柱干燥。

步驟5:DNA洗脫與收集

  • 目的:將純化的DNA從吸附柱上洗脫。
  • 操作
    1. 將吸附柱轉移至新的1.5mL離心管,向膜中央加入100-200μL預熱至65℃的Buffer AE。
    2. 室溫靜置5分鐘,8000×g離心1分鐘。
    3. 可選擇重復洗脫一次以提高回收率(將洗脫液重新加入吸附柱,再次離心)。

三、關鍵注意事項

  1. 溫度控制
    • 蛋白酶K裂解步驟需在56℃進行,溫度過低會導致裂解不完全。
    • 洗脫液預熱至65℃可提高DNA洗脫效率。
  2. 乙醇添加
    • 若洗滌液需自行添加乙醇,務必使用無水乙醇,并確保終濃度符合試劑盒要求。
  3. 離心條件
    • 離心速度和時間需嚴格遵循說明書,避免DNA斷裂或吸附不完全。
  4. 避免污染
    • 所有操作應在無菌條件下進行,使用無DNA酶的耗材和移液器吸頭。

四、結果評估

  • 濃度與純度:使用分光光度計測定DNA濃度(A260)和純度(A260/A280=1.8-2.0)。
  • 完整性:通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶(主帶應集中于基因組DNA大小區(qū)域)。

五、常見問題與解決方案

 
問題 可能原因 解決方案
DNA濃度低 樣本量不足或裂解不完全 增加樣本量,延長裂解時間
A260/A280比值異常 蛋白質污染 增加洗滌次數,確保乙醇去除
DNA降解 操作粗暴或反復凍融 輕柔操作,分裝保存于-20℃

通過以上步驟,可高效提取高質量基因組DNA,適用于PCR、測序、Southern blot等下游實驗。不同試劑盒的具體操作細節(jié)可能略有差異,務必參考對應說明書。

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