實時熒光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時監(jiān)測從而實現(xiàn)對起始模板的定性及定量分析。目前它主要通過兩種方式——熒光染料或者熒光標(biāo)記的探針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

熒光定量PCR，qPCR

熒光染料法

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，該染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，并不與單鏈DNA鏈結(jié)合，而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可以發(fā)光，因此，在PCR體系中，隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，每個循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。

武漢艾美捷科技專注為客戶提供整體打包方案，可提供EvaGreen、SolisGreen和SYBR等多種染料qPCR預(yù)混液。

EvaGreen、SolisGreen、SYBR染料

熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在丨常用的SYBR GreenⅠ,EvaGreen、SolisGreen屬于飽和熒光染料。非飽和熒光染料在濃度高的時候會對PCR過程產(chǎn)生抑制，所以在熒光定量實驗時使用濃度稍低，染料不能占據(jù)DNA雙鏈上的所有位置。當(dāng)PCR隨著溫度上升，雙鏈逐漸解鏈，染料會從已解開的單鏈上脫落，然后結(jié)合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中去繼續(xù)發(fā)熒光。這種染料重排導(dǎo)致在較小的溫度變化內(nèi)，雖然DNA雙鏈的解鏈過程不同，但熒光值是幾乎不變的，也就是說，其溶解曲線不能精確反應(yīng)雙鏈的解鏈情況。

所以，對于非飽和染料，其溶解曲線分辨率相對較低，只能區(qū)分特異性的產(chǎn)物，不能分辨單堿基的差異。飽和熒光染料在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點內(nèi)都會有染料分子存在，染料與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)，隨著溫度上升，在雙鏈解鏈、染料脫離過程中，未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結(jié)合的位點，染料不能發(fā)生重排。所以使用飽和染料制作的溶解曲線分辨率很高，可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況，精度可以達(dá)到單堿差異的區(qū)分。

熒光標(biāo)記的探針法

PCR擴(kuò)增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)， 探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴(kuò)增時（在延伸階段），Taq 酶的5'→3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成*同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。

SYBR染料qPCR預(yù)混液2.0，貨號：QP031

5x 多重探針qPCR預(yù)混液，貨號：08-01-00001

快速探針qPCR預(yù)混液，貨號：28-21-00001

5×探針qPCR預(yù)混液,ROX，貨號：QP036

5×qPCR預(yù)混液，貨號：08-24-00001

染料法VS探針法

1.探針法通過探針可以增加反應(yīng)收集信號的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號，探針法能夠用多重體系反應(yīng)，能夠預(yù)測和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點是要合成探針，成本高

2.染料法經(jīng)濟(jì)實惠，可以做溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的TM值，缺點就是特異性沒有探針法好

艾美捷科技有限公司，通過提供完整的產(chǎn)品和服務(wù)體系、便利的客戶關(guān)系和供應(yīng)鏈管理，為生命科學(xué)研究工作者提供整體打包方案。我們的企業(yè)的核心價值觀：“激情、敬業(yè)、學(xué)習(xí)、創(chuàng)新、合作、卓丨越”。激發(fā)我們內(nèi)在的創(chuàng)造力，提供有競爭力的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品和服務(wù)，持續(xù)為客戶創(chuàng)造大價值是我們的企業(yè)使命。我們的企業(yè)愿景是成為受人尊重、世界1流的生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品及服務(wù)供應(yīng)商。更多精彩關(guān)注艾美捷公眾號：amyjetsci