中性蛋白酶指能夠在中性或弱酸、弱堿性環(huán)境中作用的一類蛋白酶,其最適作用pH介于6.0~7.5,能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解,具有催化反應(yīng)速度快無工業(yè)污染反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等優(yōu)點(diǎn)，中性蛋白酶能在中性條件下水解食品中蛋白質(zhì)的肽鍵,釋放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒·果汁、啤酒和黃油生產(chǎn)中,添加中性蛋白酶可澄清發(fā)酵液中的霧氣。酵母在發(fā)酵階段的生長可以通過懸浮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的氨基酸來加以促進(jìn),從而加速發(fā)酵并提高產(chǎn)量。

中性蛋白酶根據(jù)催化機(jī)制和活性中心蛋白酶功能基團(tuán)不同可以分為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶四大類。

艾美捷中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）是一種非哺乳動(dòng)物來源的無（AOF）金屬中性蛋白酶，通過沃辛頓開發(fā)的方法純化。其溫和的蛋白水解作用使該酶特別適用于原代細(xì)胞和二次（亞培養(yǎng)）細(xì)胞培養(yǎng)的制備，因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)胞膜溫和。這種蛋白酶還用作細(xì)胞分離和組織解離應(yīng)用中的二級(jí)酶，通常與膠原蛋白一起使用。

中性蛋白酶（分散酶）的測(cè)定：

方法

在過氧化物酶偶聯(lián)系統(tǒng)中，通過測(cè)量D-丙氨酸氧化引起的A436的增加來確定反應(yīng)速度。一個(gè)單位每分鐘氧化一微摩爾的D-丙氨酸，為37？C和pH 8.3在規(guī)定條件下。

試劑

這種酶的性質(zhì)要求準(zhǔn)確制備底物。請(qǐng)注意按照以下說明進(jìn)行操作。

1M 三重奏

緩沖液-底物（2%酪蛋白在0.05M Tris緩沖液中）：攪拌約1分鐘，將0.40gm酪蛋白（USB級(jí)或同等產(chǎn)品）溶解在0.1ml試劑級(jí)水中。加入0.1毫升2N NaOH和5.1毫升0.7M Tris。讓底物攪拌直至酪蛋白進(jìn)入溶液。pH至8.5，用稀磷酸繼續(xù)攪拌50分鐘。用試劑級(jí)水制成最終體積為0.<>ml。在移液底物之前，請(qǐng)確保底物始終均勻，并且酪蛋白沒有從溶液中掉出。如果酪蛋白似乎已從溶液中脫落，請(qǐng)勿使用底物進(jìn)行測(cè)定。

酶活化劑 - 0.01 M 氯化鈣2：溶解147毫克氯化鈣2在100毫升試劑級(jí)水中。不使用時(shí)，請(qǐng)放入冰箱。

5%TCA：將5克TCA溶解在100毫升試劑級(jí)水中。在室溫下保存。

酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：在試劑級(jí)水中以10 μ摩爾/ ml的濃度制備10毫升。（181微克酪氨酸= 1微摩爾）。稱取18.1mg酪氨酸，攪拌至初始沸騰溶解于10ml試劑級(jí)水中。從火上移開并冷卻至約40°C進(jìn)行測(cè)定。

0.5 M NaOH：將 1 g. 溶解在 50 ml 試劑級(jí)水中，或從 1M 或 10M NaOH 稀釋。

Folin & Ciocalteus 苯酚試劑，使用純凈

酶

溶于濃度為5mg / ml的去離子水中，并制備1：50稀釋液。使用25μl和50μl一式兩份。

程序

要清除玻璃管，請(qǐng)使用巴斯德移液管加入 1.0 ml 緩沖底物、20 μL 0.01M CaCl 2 和兩級(jí)酶稀釋液：25μl 和 50μl，每級(jí)一式兩份。還包括兩個(gè)用于空白的無酶管，以及四個(gè)用于酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的管，帶有1ml緩沖底物，以及25μl，50μl，75μl和100μl酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在15°C的水浴中孵育37分鐘。通過加入2ml 5%TCA停止反應(yīng)?；旌厦總€(gè)試管，然后使用臺(tái)式 Sorvall 或等效物以 2000 rpm 離心 10 分鐘。從每個(gè)試管中取出（定量）1ml上清液，并加入標(biāo)記的干凈玻璃管中。然后在每個(gè)試管中加入2.0ml 0.5M NaOH?；旌?，然后加入0.1ml Folin-Ciacalteu試劑，550分鐘后在A10處讀取。圖 A550 與微摩爾酪氨酸。繪制最佳擬合線并選擇落在線的線性部分內(nèi)的樣本讀數(shù)，并按下面列出的方式進(jìn)行計(jì)算。

計(jì)算

繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在 A550 和酪氨酸微摩爾之間建立等效性。例如，使用50μl酶，稀釋50倍，A550處的讀數(shù)為0.26。從酪氨酸曲線A550的0.26相當(dāng)于0.75微摩爾酪氨酸。

中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）相關(guān)研究：

膠原酶 （CLS1-4/CLSS1-4/CLSPA）脫氧核糖核酸酶 I （DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF） 彈性蛋白酶 （ES/ESL/ESFF）透明質(zhì)酸酶 （HSE/HSEP）木瓜蛋白酶 （PAP/PAPL/PAP2）蛋白酶 K （PROK）胰蛋白酶 （TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK）胰蛋白酶抑制劑 （LBI/OI/SI/SIC）細(xì)胞分離優(yōu)化系統(tǒng)（CIT）肝細(xì)胞分離系統(tǒng)（HIS）新生兒心肌細(xì)胞分離系統(tǒng)（NCIS）木瓜蛋白酶分離系統(tǒng)（PDS/PDS2）