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中性蛋白酶指能夠在中性或弱酸、弱堿性環(huán)境中作用的一類(lèi)蛋白酶,其最適作用pH介于6.0~7.5,能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解,具有催化反應(yīng)速度快無(wú)工業(yè)污染反應(yīng)條件適應(yīng)性寬等優(yōu)點(diǎn),中性蛋白酶能在中性條件下水解食品中蛋白質(zhì)的肽鍵,釋放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒·果汁、啤酒和黃油生產(chǎn)中,添加中性蛋白酶可澄清發(fā)酵液中的霧氣。酵母在發(fā)酵階段的生長(zhǎng)可以通過(guò)懸浮蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的氨基酸來(lái)加以促進(jìn),從而加速發(fā)酵并提高產(chǎn)量。
中性蛋白酶根據(jù)催化機(jī)制和活性中心蛋白酶功能基團(tuán)不同可以分為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶四大類(lèi)。
艾美捷中性蛋白酶(Dispase®)(WBC-LS02112)是一種非哺乳動(dòng)物來(lái)源的無(wú)(AOF)金屬中性蛋白酶,通過(guò)沃辛頓開(kāi)發(fā)的方法純化。其溫和的蛋白水解作用使該酶特別適用于原代細(xì)胞和二次(亞培養(yǎng))細(xì)胞培養(yǎng)的制備,因?yàn)樗鼘?duì)細(xì)胞膜溫和。這種蛋白酶還用作細(xì)胞分離和組織解離應(yīng)用中的二級(jí)酶,通常與膠原蛋白一起使用。
中性蛋白酶(分散酶)的測(cè)定:
方法
在過(guò)氧化物酶偶聯(lián)系統(tǒng)中,通過(guò)測(cè)量D-丙氨酸氧化引起的A436的增加來(lái)確定反應(yīng)速度。一個(gè)單位每分鐘氧化一微摩爾的D-丙氨酸,為37?C和pH 8.3在規(guī)定條件下。
試劑
這種酶的性質(zhì)要求準(zhǔn)確制備底物。請(qǐng)注意按照以下說(shuō)明進(jìn)行操作。
1M 三重奏
緩沖液-底物(2%酪蛋白在0.05M Tris緩沖液中):攪拌約1分鐘,將0.40gm酪蛋白(USB級(jí)或同等產(chǎn)品)溶解在0.1ml試劑級(jí)水中。加入0.1毫升2N NaOH和5.1毫升0.7M Tris。讓底物攪拌直至酪蛋白進(jìn)入溶液。pH至8.5,用稀磷酸繼續(xù)攪拌50分鐘。用試劑級(jí)水制成最終體積為0.<>ml。在移液底物之前,請(qǐng)確保底物始終均勻,并且酪蛋白沒(méi)有從溶液中掉出。如果酪蛋白似乎已從溶液中脫落,請(qǐng)勿使用底物進(jìn)行測(cè)定。
酶活化劑 - 0.01 M 氯化鈣2:溶解147毫克氯化鈣2在100毫升試劑級(jí)水中。不使用時(shí),請(qǐng)放入冰箱。
5%TCA:將5克TCA溶解在100毫升試劑級(jí)水中。在室溫下保存。
酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品:在試劑級(jí)水中以10 μ摩爾/ ml的濃度制備10毫升。(181微克酪氨酸= 1微摩爾)。稱(chēng)取18.1mg酪氨酸,攪拌至初始沸騰溶解于10ml試劑級(jí)水中。從火上移開(kāi)并冷卻至約40°C進(jìn)行測(cè)定。
0.5 M NaOH:將 1 g. 溶解在 50 ml 試劑級(jí)水中,或從 1M 或 10M NaOH 稀釋。
Folin & Ciocalteus 苯酚試劑,使用純凈
酶
溶于濃度為5mg / ml的去離子水中,并制備1:50稀釋液。使用25μl和50μl一式兩份。
程序
要清除玻璃管,請(qǐng)使用巴斯德移液管加入 1.0 ml 緩沖底物、20 μL 0.01M CaCl 2 和兩級(jí)酶稀釋液:25μl 和 50μl,每級(jí)一式兩份。還包括兩個(gè)用于空白的無(wú)酶管,以及四個(gè)用于酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的管,帶有1ml緩沖底物,以及25μl,50μl,75μl和100μl酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在15°C的水浴中孵育37分鐘。通過(guò)加入2ml 5%TCA停止反應(yīng)?;旌厦總€(gè)試管,然后使用臺(tái)式 Sorvall 或等效物以 2000 rpm 離心 10 分鐘。從每個(gè)試管中取出(定量)1ml上清液,并加入標(biāo)記的干凈玻璃管中。然后在每個(gè)試管中加入2.0ml 0.5M NaOH。混合,然后加入0.1ml Folin-Ciacalteu試劑,550分鐘后在A10處讀取。圖 A550 與微摩爾酪氨酸。繪制最佳擬合線并選擇落在線的線性部分內(nèi)的樣本讀數(shù),并按下面列出的方式進(jìn)行計(jì)算。
計(jì)算
繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在 A550 和酪氨酸微摩爾之間建立等效性。例如,使用50μl酶,稀釋50倍,A550處的讀數(shù)為0.26。從酪氨酸曲線A550的0.26相當(dāng)于0.75微摩爾酪氨酸。
中性蛋白酶(Dispase®)(WBC-LS02112)相關(guān)研究:
膠原酶 (CLS1-4/CLSS1-4/CLSPA)脫氧核糖核酸酶 I (DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF) 彈性蛋白酶 (ES/ESL/ESFF)透明質(zhì)酸酶 (HSE/HSEP)木瓜蛋白酶 (PAP/PAPL/PAP2)蛋白酶 K (PROK)胰蛋白酶 (TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK)胰蛋白酶抑制劑 (LBI/OI/SI/SIC)細(xì)胞分離優(yōu)化系統(tǒng)(CIT)肝細(xì)胞分離系統(tǒng)(HIS)新生兒心肌細(xì)胞分離系統(tǒng)(NCIS)木瓜蛋白酶分離系統(tǒng)(PDS/PDS2)
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