中性蛋白酶指能夠在中性或弱酸、弱堿性環(huán)境中作用的一類蛋白酶,其最適作用pH介于6.0~7.5,能催化蛋白質肽鍵水解,具有催化反應速度快無工業(yè)污染反應條件適應性寬等優(yōu)點，中性蛋白酶能在中性條件下水解食品中蛋白質的肽鍵,釋放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒·果汁、啤酒和黃油生產中,添加中性蛋白酶可澄清發(fā)酵液中的霧氣。酵母在發(fā)酵階段的生長可以通過懸浮蛋白質轉化的氨基酸來加以促進,從而加速發(fā)酵并提高產量。

中性蛋白酶根據催化機制和活性中心蛋白酶功能基團不同可以分為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶四大類。

艾美捷中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）是一種非哺乳動物來源的無（AOF）金屬中性蛋白酶，通過沃辛頓開發(fā)的方法純化。其溫和的蛋白水解作用使該酶特別適用于原代細胞和二次（亞培養(yǎng)）細胞培養(yǎng)的制備，因為它對細胞膜溫和。這種蛋白酶還用作細胞分離和組織解離應用中的二級酶，通常與膠原蛋白一起使用。

中性蛋白酶（分散酶）的測定：

方法

在過氧化物酶偶聯系統中，通過測量D-丙氨酸氧化引起的A436的增加來確定反應速度。一個單位每分鐘氧化一微摩爾的D-丙氨酸，為37？C和pH 8.3在規(guī)定條件下。

試劑

這種酶的性質要求準確制備底物。請注意按照以下說明進行操作。

1M 三重奏

緩沖液-底物（2%酪蛋白在0.05M Tris緩沖液中）：攪拌約1分鐘，將0.40gm酪蛋白（USB級或同等產品）溶解在0.1ml試劑級水中。加入0.1毫升2N NaOH和5.1毫升0.7M Tris。讓底物攪拌直至酪蛋白進入溶液。pH至8.5，用稀磷酸繼續(xù)攪拌50分鐘。用試劑級水制成最終體積為0.<>ml。在移液底物之前，請確保底物始終均勻，并且酪蛋白沒有從溶液中掉出。如果酪蛋白似乎已從溶液中脫落，請勿使用底物進行測定。

酶活化劑 - 0.01 M 氯化鈣2：溶解147毫克氯化鈣2在100毫升試劑級水中。不使用時，請放入冰箱。

5%TCA：將5克TCA溶解在100毫升試劑級水中。在室溫下保存。

酪氨酸標準品：在試劑級水中以10 μ摩爾/ ml的濃度制備10毫升。（181微克酪氨酸= 1微摩爾）。稱取18.1mg酪氨酸，攪拌至初始沸騰溶解于10ml試劑級水中。從火上移開并冷卻至約40°C進行測定。

0.5 M NaOH：將 1 g. 溶解在 50 ml 試劑級水中，或從 1M 或 10M NaOH 稀釋。

Folin & Ciocalteus 苯酚試劑，使用純凈

酶

溶于濃度為5mg / ml的去離子水中，并制備1：50稀釋液。使用25μl和50μl一式兩份。

程序

要清除玻璃管，請使用巴斯德移液管加入 1.0 ml 緩沖底物、20 μL 0.01M CaCl 2 和兩級酶稀釋液：25μl 和 50μl，每級一式兩份。還包括兩個用于空白的無酶管，以及四個用于酪氨酸標準品的管，帶有1ml緩沖底物，以及25μl，50μl，75μl和100μl酪氨酸標準溶液。在15°C的水浴中孵育37分鐘。通過加入2ml 5%TCA停止反應?；旌厦總€試管，然后使用臺式 Sorvall 或等效物以 2000 rpm 離心 10 分鐘。從每個試管中取出（定量）1ml上清液，并加入標記的干凈玻璃管中。然后在每個試管中加入2.0ml 0.5M NaOH?；旌希缓蠹尤?span style="font-family: Calibri;">0.1ml Folin-Ciacalteu試劑，550分鐘后在A10處讀取。圖 A550 與微摩爾酪氨酸。繪制最佳擬合線并選擇落在線的線性部分內的樣本讀數，并按下面列出的方式進行計算。

計算

繪制酪氨酸標準品的標準曲線。在 A550 和酪氨酸微摩爾之間建立等效性。例如，使用50μl酶，稀釋50倍，A550處的讀數為0.26。從酪氨酸曲線A550的0.26相當于0.75微摩爾酪氨酸。

中性蛋白酶（Dispase®）（WBC-LS02112）相關研究：

膠原酶 （CLS1-4/CLSS1-4/CLSPA）脫氧核糖核酸酶 I （DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF） 彈性蛋白酶 （ES/ESL/ESFF）透明質酸酶 （HSE/HSEP）木瓜蛋白酶 （PAP/PAPL/PAP2）蛋白酶 K （PROK）胰蛋白酶 （TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK）胰蛋白酶抑制劑 （LBI/OI/SI/SIC）細胞分離優(yōu)化系統（CIT）肝細胞分離系統（HIS）新生兒心肌細胞分離系統（NCIS）木瓜蛋白酶分離系統（PDS/PDS2）