鈣黃綠素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，可同時(shí)使用，對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。Calcein-AM 的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細(xì)胞膜。盡管 Calcein-AM 本身并不是熒光分子，但通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM 能脫去 AM 基，產(chǎn)生的 Calcein 能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光 (激發(fā): 490 nm，發(fā)射: 515 nm)，因此 Calcein-AM 僅對(duì)活細(xì)胞染色。另一方面，作為核染色染料的 PI 不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的 DNA 雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 (激發(fā): 535 nm，發(fā)射: 617 nm)。由于 Calcein 和PI-DNA都可被 490 nm 激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用 545 nm 激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。

艾美捷 Biogradetech Calcein-AM/PI，活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒：

中文名稱：Calcein-AM/PI，活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒

英文名字：Calcein-AM/PI, Live/Dead Cell Double Staining Kit

Biogradetech貨號(hào)：B-CHK103-500T

規(guī)格：500T

保存建議：Calcein-AM/PI，活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒保存：-20℃干燥避光 有效期一年。

Calcein-AM/PI，活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒使用方法：

以 HeLa 細(xì)胞染色為例，請(qǐng)注意不同的細(xì)胞種類、不同濃度，有不同的觀察條件。

1. 染色工作液的配制

添加 2.5 µl Calcein-AM 儲(chǔ)備液（4mM）和 12.5 µl PI（2mM）儲(chǔ)備液至 5 ml PBS 中配制成染色溶液。Calcein-AM的終濃度為 2 µM，PI 的終濃度為 5 µM。

注意：由于 Calcein-AM 的穩(wěn)定性比較差，此染色工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，并且在當(dāng)天用完。

2. 細(xì)胞染色

1) 染色 HeLa 細(xì)胞等貼壁細(xì)胞時(shí)，先用 Trypsin-EDTA 等消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。

2) 將細(xì)胞懸液離心 3 分鐘 (1,000 rpm)。

3) 去除上清液，加入 PBS 緩沖液，細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至 1×105-1×106個(gè)/ml。再用移液器充分混勻。

4) 由于培養(yǎng)基中的血清等成分含有酯酶，Calcein-AM 會(huì)分解，會(huì)導(dǎo)致空白上升，所以需要離心數(shù)次，用PBS 洗滌數(shù)次直到完-全洗凈。

5) 將 200 µl 細(xì)胞懸液移至小試管中，加入 100 µl 染色溶液，在 37℃下孵育 15 分鐘。

6) 在蓋玻片上滴加適量的染色的細(xì)胞溶液。

7) 在熒光顯微鏡下，先用 490±10 nm 波長(zhǎng)激發(fā)，觀察黃綠色的活細(xì)胞，還可以同時(shí)觀察到紅色的死細(xì)胞，然后用545 nm波長(zhǎng)激發(fā)，能夠看到紅色的死細(xì)胞。