SiR-微管蛋白基于硅羅丹明（SiR）熒光團和微管結(jié)合藥物多西他賽。SiR-微管蛋白能夠以高特異性和低背景在活細(xì)胞中標(biāo)記微管（1）。SiR-微管蛋白的關(guān)鍵特性包括：i）遠(yuǎn)紅光吸收和發(fā)射波長；ii）細(xì)胞通透性；iii）熒光生成特性；iv）與超分辨率顯微鏡（STED和SIM）的兼容性。這些特性在一個探針中的d特組合使SiR-微管蛋白處于優(yōu)質(zhì)前沿。

艾美捷SiR-微管蛋白試劑盒（#CY-SC002）物理特性：

吸收波長（λabs）：652 nm

發(fā)射波長（λem）：674 nm

652 nm處的摩爾吸光系數(shù)（ε）：1.0×10? mol?1·cm?1

分子量（MW）：1303.6 g/mol

分子式（MF）：C₇₃H₈₆N₄O₁₆S

儲存與操作：

收到后將化合物儲存于-20°C以下。使用無水DMSO配制化合物溶液。使用后將化合物溶液儲存于-20°C以下。在打開前，應(yīng)將小瓶恢復(fù)至室溫。如果儲存得當(dāng)，化合物應(yīng)可在數(shù)月內(nèi)保持穩(wěn)定。注意：DMSO溶液應(yīng)特別小心處理，因為DMSO已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關(guān)的當(dāng)?shù)匾?guī)定處理這些試劑。

標(biāo)記協(xié)議：

注意：本協(xié)議是使用貼壁于蓋玻片的人類成纖維細(xì)胞優(yōu)化的，并已在其他常見細(xì)胞系中得到驗證。實驗協(xié)議的建議應(yīng)作為起點，每種細(xì)胞類型的優(yōu)標(biāo)記條件應(yīng)通過實驗確定。SiR-微管蛋白基于微管穩(wěn)定藥物多西他賽，因此可以改變活細(xì)胞中微管的動態(tài)。盡管間期細(xì)胞受探針影響較小，但在培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞中，超過100 nM的SiR-微管蛋白濃度會導(dǎo)致有絲分裂期延長（1）。如果計劃進行長期成像實驗且微管動態(tài)至關(guān)重要，建議將SiR-微管蛋白的濃度保持在100 nM或以下。對于其他用途，建議使用1 µM的SiR-微管蛋白進行染色。

1. 配制1 mM儲備液：將SiR-微管蛋白小瓶的內(nèi)容物溶解在50 µL無水DMSO中，制備1 mM儲備液。該溶液應(yīng)儲存于-20°C或更低溫度。不要將溶液分裝成小份，因為它們會更快降解，且該化合物不會因多次凍融循環(huán)而改變。如果儲存得當(dāng)，該儲備液應(yīng)可在三個月或更長時間內(nèi)保持穩(wěn)定。如果需要準(zhǔn)確測定儲備液的濃度，可將1 µL 1 mM儲備液稀釋在99 µL含有0.2% SDS的PBS中。在室溫下靜置15分鐘后，在652 nm處測量吸光度。使用上述給定的消光系數(shù)計算濃度。

2. 配制染色液：在細(xì)胞培養(yǎng)基（例如DMEM + 10%胎牛血清）中將SiR-微管蛋白稀釋至所需濃度，并短暫渦旋。由于染色效率可能因細(xì)胞系而異，建議s次嘗試時使用1 µM濃度以快速獲得強染色效果，然后在后續(xù)實驗中降低SiR-微管蛋白濃度，直至獲得最佳染色效果（參見下表中的標(biāo)記濃度和孵育時間）。某些細(xì)胞系可能表達(dá)高水平的外排泵，因此SiR-微管蛋白染色效果較差。在染色液中加入10 µM維拉帕米（一種廣譜外排泵抑制劑）通?？梢燥@著改善染色效果。

3. 細(xì)胞準(zhǔn)備和染色：按照常規(guī)方法在蓋玻片、玻璃底培養(yǎng)皿或玻璃底多孔板上培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需密度時，用染色液替換培養(yǎng)基，確保所有細(xì)胞都被溶液覆蓋。將細(xì)胞置于37°C、含5% CO?的濕潤環(huán)境中孵育，并根據(jù)標(biāo)記時間作為探針濃度的函數(shù)。

*標(biāo)記時間是針對人類成纖維細(xì)胞確定的，可能會因使用的細(xì)胞系而有所不同。

重要提示：SiR-微管蛋白不能染色用甲醛（PFA）和甲醇固定的細(xì)胞，因為這些固定方法會改變微管上探針的結(jié)合位點。

細(xì)胞成像：使用標(biāo)準(zhǔn)Cy5設(shè)置對SiR-微管蛋白進行成像效果佳。標(biāo)記后，活細(xì)胞可以立即成像，無需洗滌步驟?？蛇x地，用不含探針的新鮮培養(yǎng)基替換一次標(biāo)記液通?？梢蕴岣咝旁氡?。如果進行時間序列成像，建議在整個實驗過程中將探針濃度保持在100 nM或以下，以獲得穩(wěn)定的信號并避免探針干擾微管動態(tài)（延長有絲分裂期和降低細(xì)胞增殖）。如果在成像前對細(xì)胞進行了洗滌，染色效果將持續(xù)數(shù)小時。

文獻(xiàn)參考：

1. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton, G. Lukinavi?ius et al., Nature Methods, 11, 731–733 (2014)