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原代細(xì)胞的培養(yǎng)，支原體污染是個(gè)世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細(xì)胞的所有參數(shù)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確、甚至*錯(cuò)誤。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細(xì)胞培養(yǎng)都要進(jìn)行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

支原體通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗各種養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸，從而改變細(xì)胞的代謝狀態(tài)。支原體可以酵解糖，分解精氨酸，氧化丙酮酸，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會使細(xì)胞代謝發(fā)生一系列改變，從而影響蛋白質(zhì)、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補(bǔ)償合成途徑。污染時(shí)間的長短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度，導(dǎo)致細(xì)胞染色體斷裂、重排、非整倍體的出現(xiàn)。隨后，細(xì)胞的生長特性發(fā)生改變，使某些酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，并表現(xiàn)出一些特殊的細(xì)胞功能，而其它一些細(xì)胞正常的功能則被抑制。某些支原體附著在細(xì)胞表面后，會與宿主細(xì)胞交換膜抗原成分。隨著細(xì)胞膜成分的改變，細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生改變。細(xì)胞污染對研究工作帶來的zui大危害是由于錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致研究誤入歧途。此外，支原體污染還會干擾細(xì)胞的篩選，如雜交瘤細(xì)胞生長受到抑制并喪失產(chǎn)生單抗的能力。

培養(yǎng)法是zui可靠的支原體檢測技術(shù)，但是該方法非常耗時(shí)的，需要數(shù)周，不適合作為細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測。有的實(shí)驗(yàn)室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，當(dāng)檢測成陽性時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。目前，細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體污染的檢測通常使用的是PCR法。

可以說，到目前為止，針對體外細(xì)胞培養(yǎng)的支原體檢測的方法還沒有一種單獨(dú)使用就可以保證100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。

（1）支原體固體培養(yǎng)法。通過固體培養(yǎng)法無法檢測污染細(xì)胞的一種zui常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因?yàn)樨i鼻支原體無法在支原體固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落，而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。這就意味支原體固體培養(yǎng)法漏檢率高達(dá)20-50%。

（2）PCR法。PCR法導(dǎo)致的假陽性大家比較熟悉，無需多說。值得注意的是，由于細(xì)胞培養(yǎng)液中，經(jīng)常會含有強(qiáng)烈抑制PCR擴(kuò)增的代謝產(chǎn)物，如果不進(jìn)行樣品的前處理而直接使用細(xì)胞培養(yǎng)原液進(jìn)行PCR檢測，產(chǎn)生假陰性的概率是非常大的。

（3）熒光染色法。由于該方法本身的靈敏度較低，輕度的支原體污染往往無法檢測出來。該方法漏檢率也不會低。

（4）各種宣稱檢測支原體特異性酶的方法，我們對此持謹(jǐn)慎態(tài)度。比如Lonza公司的依據(jù)支原體特異性酶而設(shè)計(jì)的支原體檢測試劑盒，其說明書就明確寫明：其結(jié)果會受到原代細(xì)胞本身的干擾，其檢測過程必須離心去除哺乳動(dòng)物細(xì)胞。這就是悖論：該支原體檢測試劑盒不是宣稱根據(jù)支原體特異性酶而設(shè)計(jì)的嗎？怎么會被哺乳動(dòng)物細(xì)胞本身干擾呢？如果會被哺乳動(dòng)物細(xì)胞本身干擾，那豈不說明哺乳動(dòng)物細(xì)胞本身也含有該酶？如此，假陽性豈能避免？由于類似的支原體檢測試劑盒說明書都沒有公布具體的支原體特異性酶的名稱，其是否會被哺乳動(dòng)物或普通的細(xì)菌、真菌干擾而產(chǎn)生假陽性，我們對此持高度謹(jǐn)慎態(tài)度。希望進(jìn)行細(xì)胞支原體污染檢測的具體人員自己好好研究鑒別一下。再者，其靈敏度如何也需要比較后才知道。

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原代細(xì)胞