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上海吉至生化科技有限公司
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2021-8-25 閱讀(1148)
酶促反應(yīng)的發(fā)光底物：
酶促反應(yīng)的發(fā)光底物是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)中常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。HRP的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物和HPA。AP的發(fā)光底物為3-（2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷（AMPPD）和4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP，熒光底物）。
魯米諾或其衍生物： 魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，通常以0.1mol/L pH8.6Tris緩沖液作底物液。要注意是:首先,魯米諾和H2O2在無(wú)HRP催化時(shí)也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強(qiáng)度測(cè)定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP發(fā)光增強(qiáng)劑如某些酚試劑（如鄰－碘酚）或螢火蟲(chóng)熒光素酶可增強(qiáng)HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)和延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，提高發(fā)光敏感度。
HPA： HPA在H2O2存在下被HRP氧化或氧化二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長(zhǎng)的熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。
AMPPD： AMPPD在堿性條件下，被ALP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP-D陰離子，其有2-30min的分解半衰期，發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光，在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰，15-60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定。
4-MUP： 4-MUP被ALP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出448nm的熒光，用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。
直接化學(xué)發(fā)光劑：
直接化學(xué)發(fā)光劑不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱?/span>pH等條件就能發(fā)光的物質(zhì)，如吖啶酯（acridinium, AE）在有過(guò)氧化氫的稀堿溶液中即能發(fā)光。
電化學(xué)發(fā)光劑：
電化學(xué)發(fā)光劑是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+（圖16-7）和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)性電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。二價(jià)的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三價(jià)，成為強(qiáng)氧化劑，TPA失去電子后被氧化成陽(yáng)離子自由基TPA+，它很不穩(wěn)定，可自發(fā)地失去一個(gè)質(zhì)子（H+），形成自由基TPA.，成為一種很強(qiáng)的還原劑，可將一個(gè)高能量的電子遞給三價(jià)的[Ru(bpy)3]3+使其形成激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.。激發(fā)態(tài)的三聯(lián)吡啶釕不穩(wěn)定，很快發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)為620nm的光子，回復(fù)到基態(tài)的三聯(lián)吡啶釕。這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，產(chǎn)生許多光子，使光信號(hào)增強(qiáng)。
