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上海吉至生化科技有限公司
主營產品： 潮霉素b,DTT二硫蘇糖醇,Albumin BovineⅤ 牛血清白蛋白Ⅴ,Zeocin 博萊霉素 1.25ml -20℃ （125mg）,IPTG 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 進口 100g |
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2023-9-6 閱讀(817)
280nm的光吸收法:
用標準曲線法進行測定。標準蛋白質溶液配制的濃度為1.0 mg/mL。常用的標準蛋白質為牛血清清蛋白(BSA)。
標準曲線的測定:
取6支試管，按下表編號并加入BSA(1.0 mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，用蒸餾水補體積至5.0 mL;測定A280 :用第1管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度A280，以A280為縱坐標，各管的蛋白質濃度或蛋白質量(mg)為橫坐標作圖，標準曲線應為直線。
利用此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的A280值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。
280 nm和260 nm的吸收差法：
核酸對紫外光有很強的吸收，在280 nm處的吸收比蛋白質強10倍(每克)，但核酸在260 nm處的吸收更強，其吸收高峰在260 nm附近。核酸260 nm處的消光系數(shù)是280 nm處的2倍;而蛋白質則相反，其280 nm的紫外吸收值大于260 nm的吸收值。通常:
純蛋白質的光吸收比值:A280/A260 =1.8
純核酸的光吸收比值:A280/A260= 0.5
含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經驗公式，即可算出蛋白質的濃度。
蛋白質濃度=1.45×A280 - 0.74×A260 (mg/mL)
215 nm與225 nm的吸收差法：
蛋白質的稀溶液由于含量低而不能使用280 nm的光吸收測定時，可用215nm與225 nm吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質稀溶液的濃度。
用已知濃度的標準蛋白質，配制成20~100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白質溶液，分別測定215 nm和225 nm的吸光度值，并計算出吸收差:
吸收差D= A215 - A225
以吸收差D為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪出標準曲線。再測出未知樣品的吸收差，即可由標準曲線上查出未知樣品的蛋白質濃度。
肽鍵測定法：
蛋白質溶液在238 nm處的光吸收的強弱，與肽鍵的多少成正比。因此可以用標準蛋白質溶液配制一系列50~500 mg/mL已知濃度的5.0 mL蛋白質溶液，測定238 nm的光吸收值A238，以A238為縱坐標，蛋白質含量為橫坐標，繪制出標準曲線。未知樣品的濃度即可由標準曲線求得。
