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Lonza 384孔高通量電轉應用:篩選藥物靶點文獻分享

2023-11-28  閱讀(261)

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當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為轉化醫(yī)學和創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。

CRISPR / Cas9已成為一種流行的基因編輯工具,因為它易于使用,并且與其他基因調(diào)節(jié)工具(例如siRNA技術)相比,脫靶效應更少。CRISPR/Cas9敲除篩選文庫的形式主要有混合文庫和陣列文庫,已被廣泛用于靶點識別和機制分析。雖然混合文庫的 CRISPR/Cas9 篩選通常更便宜且耗時更少,但陣列式 CRISPR/Cas9 篩選在終點功能分析中提供了更多的技術靈活性。此外,與混合文庫的 CRISPR 方法相比,陣列式 CRISPR/Cas9 篩選的基因型-表型相關性通常更加直接。

全基因組 CRISPR 篩選以識別人肝星狀細胞中TGF-β 誘導的肝纖維化的驅(qū)動因素

題目

Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells

日期

2022-03-11

期刊

ACS Chem Biol



2022年3月11日,Takeda公司的開發(fā)團隊在ACS Chem Biol上發(fā)表題為Genome-wide CRISPR Screening to Identify Drivers of TGF-β-Induced Liver Fibrosis in Human Hepatic Stellate Cells 的文章,為了進一步了解肝纖維化的驅(qū)動機制,作者開發(fā)了一個高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺來鑒定肝星狀細胞(HSC)來源的TGF-β誘導的肝纖維化。該研究描述的功能基因組學表型篩選平臺揭示了TGF-β誘導的肝纖維化的新生物學機制和肝纖維化的潛在藥物靶點。

作者使用ACTA2蛋白表達作為HSC激活的水平,首先確認了HSC對TGF-β的反應,并確認了進行CRISPR/Cas9的最佳轉染條件,包括電脈沖參數(shù),crRNA及tracrRNA濃度,轉染的細胞數(shù),鋪板密度等。



隨后按照以下工作流程使用陣列式全基因組CRISPR/Cas9進行高通量篩選敲除潛在靶基因,通過計算ACTA2表達的抑制百分比及細胞活率,最終從19,027個基因中篩選出了52個基因,其中部分基因為已經(jīng)被預測可以通過傳統(tǒng)的小分子和抗體藥物來調(diào)節(jié)干預。



為了確認這些基因在改善HSC纖維化方面的作用,作者在HSC中單獨敲除了這些基因,并評估這些基因的缺失對TGF-β誘導的14種生物標志物轉錄譜的影響。



同時,構建器官型肝模型進行共培養(yǎng),評估纖維化模型中上述基因的表達水平。與GEO profiles數(shù)據(jù)庫中發(fā)布的公開可用的轉錄組數(shù)據(jù)進行對比分析。結果進一步支持了作者篩選的基因在肝纖維化發(fā)病過程中對HSC的潛在調(diào)控作用。



對生物標志物轉錄譜影響的實驗中,作者發(fā)現(xiàn)PSMC2的缺失可以抑制多個標志物,并進一步確認小分子抑制蛋白酶體活性可以解決TGF-β誘導的HSC活化。



隨后,作者評估了小鼠肝纖維化bacTRAP試驗中候選基因的表達水平,確認了這些候選基因在HSC中特異性富集。

作者還在UK Biobank上進行了MAGMA分析,確認部分基因的遺傳變異可能會影響NASH和肝纖維化的生物標志物。

最后作者總結了這些研究的結果并對每個靶基因進行了評分。更高的分數(shù)表明該基因可能是肝纖維化的潛在靶標。



總之,作者通過構建肝纖維化的生理模型,通過高通量全基因組CRISPR/Cas9篩選平臺從19,027個基因中篩選出52個潛在基因可能在激活的HSC誘導的肝纖維化中起作用,通過一系列的驗證及對比并為10個基因進行評分,這些基因?qū)殚_發(fā)下一代肝纖維化療法提供了進一步可能。

當前生物醫(yī)藥行業(yè)面臨著藥物靶點同質(zhì)化嚴重的問題,確認疾病的作用機制并尋找全新的、有效的、安全的藥物靶點將成為創(chuàng)新藥物開發(fā)的有效措施,基于高通量全基因組CRISPR篩選可以為此提供很好的幫助。本研究中使用了Lonza的384-well高通量Nucleofector做為遞送CRISPR/Cas9的工具,在短時間內(nèi)完成全基因組CRISPR/Cas9篩選。

在近幾年的科學研究中,我們也看到了384-well Nucleofector可以很好的幫助客戶完成高通量CRISPR/Cas9篩選,siRNA篩選以及細菌的CRISPR-Prime編輯的工作中[1-6]。更多疾病機理研究和藥物開發(fā)應用案例,可參考文章





基于成熟的 NucleofectorTM 技術

快速 —— 1分鐘內(nèi)處理一個384孔板

易于使用 —— 使用現(xiàn)有的96 孔 Shuttle 方案

材料消耗與高性能結合 —— 轉染細胞數(shù)可低至2×104

自動化兼容 —— 專為集成到液體處理平臺而設計

基于20年在外源基因轉導方法的開發(fā)經(jīng)驗,及大量的客戶反饋,Lonza開發(fā)出的4D-NucleofectorTM靈活性和可靠性滿足客戶的需求。除384-well Nucleofector外,Lonza還可以提供不同維度的轉染模塊來應對不同的場景需求。




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