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隨著越來(lái)越多的生物制品進(jìn)入治療領(lǐng)域，該類制品的質(zhì)量控制也日趨嚴(yán)格，其中核酸殘留一項(xiàng)是各類質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的重中之重，因?yàn)镈NA的穩(wěn)定性，容易在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生殘留，而這些生物制品應(yīng)用到人類疾病治療時(shí)，會(huì)帶來(lái)不可控危險(xiǎn)因素。終產(chǎn)品的宿主核酸殘留量必須遵循WHO、FDA和EMEA以及我國(guó)NMPA監(jiān)管條例。尤其近年來(lái)包括進(jìn)口產(chǎn)品在內(nèi)的狂犬疫苗DNA殘留超標(biāo)問(wèn)題，引起了社會(huì)和業(yè)界的廣泛關(guān)注。
生產(chǎn)生物制品的宿主細(xì)胞多是連續(xù)傳代細(xì)胞(continuouscelllines, CCLs)，其調(diào)控生長(zhǎng)的基因失靈，而擁有無(wú)限增殖的能力，CCLs的殘留DNA可能使人體細(xì)胞生長(zhǎng)失控，變成腫瘤細(xì)胞。所以需要嚴(yán)格控制生物制品的殘余DNA，避免這種風(fēng)險(xiǎn)危害。1984年的國(guó)際會(huì)議上采納了殘余DNA的臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)，即來(lái)自CCLs的生物制品DNA殘留不能超過(guò)10pg/人份劑量。1986年WHO的會(huì)議指出殘余宿主DNA的主要風(fēng)險(xiǎn)與其潛在致瘤活性有關(guān)。
此外，殘余DNA中可能存在感染性病毒基因組，病毒基因組能夠擴(kuò)增并產(chǎn)生感染性病毒粒子。體外實(shí)驗(yàn)表明，1pg逆轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒DNA就具有感染性。有些殘留DNA可能攜帶HIV病毒或者Ras致癌基因，DNA感染性風(fēng)險(xiǎn)可能比致瘤風(fēng)險(xiǎn)更高。
另外，有學(xué)者認(rèn)為，接種幾十針疫苗后，其殘余的DNA累積可能具有其他潛在危害：未發(fā)生降解的外源DNA，在哺乳細(xì)胞基因LINE-1的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子作用下有插入細(xì)胞基因組的可能性，帶來(lái)其他潛在風(fēng)險(xiǎn)。
而且，由于微生物來(lái)源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內(nèi)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)，可能增加體內(nèi)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生DNA抗體。
因此從安全角度，在生物制品的生產(chǎn)工藝中必須有去除DNA的步驟，并進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證。有研究采用病毒DNA定量感染的方法評(píng)價(jià)DNA的滅活程度，采用逐典全能核酸酶可消除其感染活性。WHO和各國(guó)藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)一般控制100pg/每劑量的殘留DNA，特殊情況下最高允許10ng/劑量。
我國(guó)部分疫苗及治療用生物制品殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)
（中國(guó)藥典2015）
| 來(lái)源 | 名稱 | 細(xì)胞 | DNA殘留標(biāo)準(zhǔn) |
| 進(jìn)口疫苗 | 小兒麻痹疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 |
| 狂犬病疫苗 | Vero | 10ng odose-1 | |
| 國(guó)產(chǎn)疫苗 | 腎綜合征出血熱疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 |
| 乙型腦炎疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 | |
| 狂犬病疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 | |
| 乙型肝炎疫苗 | Vero | 10pg 劑量-1 | |
| 甲型肝炎滅活疫苗 | Vero | 100pg 劑量-1 | |
| 治療性生物制品 | EPO、單克隆抗體等 | CHO | 100pg 劑量-1 |
| 干擾素、GM-CSF、白介素等 | E.coli/Yeast | 10pg 劑量-1 |
我國(guó)參照WHO、FDA和歐盟標(biāo)準(zhǔn)，很早就對(duì)生物制品中殘余DNA含量進(jìn)行限制。從衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點(diǎn)》到近年的《中國(guó)生物制品規(guī)程》和藥典，都對(duì)DNA殘留做了嚴(yán)格要求，部分標(biāo)準(zhǔn)高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。美國(guó)藥典2015版（USP38-NF33）中增加了新的章節(jié)（General Chapter<30>）來(lái)進(jìn)一步規(guī)范殘留DNA的檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。新版USP中將推薦qPCR法作為生物制品中的宿主殘留DNA檢測(cè)方法。
此外，在CAR-T細(xì)胞治療中，病毒包裝后的核酸去除也是必要質(zhì)量控制，必須保證回輸?shù)募?xì)胞足夠純，減低風(fēng)險(xiǎn)和危害。
除卻生物制品中必須要去除核酸殘留，在平常的蛋白提取、生化分析樣品回收中，核酸殘留的影響也是非常大的，有效去除核酸殘留，可明顯降低細(xì)胞裂解液粘度，提高蛋白得率，蛋白生化分析中也可提高分辨率，并提高回收率。
在核酸殘留去除工作中，難點(diǎn)是由于DNA帶有大量的電荷易與其他生物大分子結(jié)合從而產(chǎn)生聚集（吸附）、包裹作用而難以除去。傳統(tǒng)的方法均存在低含量核酸殘留去除不凈、工作量大耗時(shí)長(zhǎng)的致命缺陷，全能核酸酶可解決此類難點(diǎn)。
常用核酸去除方法
| 方法 | 作用 | 特點(diǎn) |
| 離子交換層析 | DNA帶有大量的負(fù)電荷，可以被陰離子交換劑吸附而除去 | 負(fù)載量大、成本低廉，其缺點(diǎn)是在DNA殘留要求較高的情況下難以達(dá)到。 |
| 魚(yú)精蛋白沉淀 | 魚(yú)精蛋白為堿性蛋白，帶有大量的正電荷，能夠與DNA結(jié)合生產(chǎn)沉淀，從而將DNA去除 | 操作簡(jiǎn)便、迅速，能有效降低DNA?殘留量。? 其缺點(diǎn)在DNA殘留要求較高的情況下難以達(dá)到；需要使用大量的魚(yú)精蛋白，容易造成魚(yú)精蛋白殘留。 |
| DNaseI | DNase Ⅰ具有DNA酶活性而不具有RNA酶活性，主要用于RNA去除DNA | 用于重組蛋白等去除DNA活性偏低，效果不理想 |
| 全能核酸酶 | 能夠降解各種形式DNA和RNA，對(duì)單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯鍵均具有很高的活性，產(chǎn)生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸 | 高效去除核酸殘留，且對(duì)核酸沒(méi)有序列要求操作簡(jiǎn)便耗時(shí)短 |
逐典Pannarase全能核酸酶是一種來(lái)源于Serratia marcescens的非特異性核酸內(nèi)切酶，該酶可以將任何形式的 DNA 和 RNA (線性、環(huán)形、超螺旋)降解成3-5bp的寡核苷酸，并可在一系列寬泛的操作條件下保持高效性。逐典全能核酸酶從E.coli中表達(dá)純化并在GMP條件下生產(chǎn)，可高效去除各種樣品中的核酸雜質(zhì)，助力解決廣大疫苗生產(chǎn)、基因和細(xì)胞治療廠商解決產(chǎn)品的核酸殘留問(wèn)題；此外某些病毒生產(chǎn)中可能會(huì)涉及到高鹽的環(huán)境，逐典Pannarase耐高鹽全能核酸酶將成為您“疑難雜癥"的選擇！
全能核酸酶優(yōu)勢(shì)：
1.無(wú)動(dòng)物源性、無(wú)氨芐青霉素
2.杰出單位比酶活、更高效的核酸降解能力
3.先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，非傳統(tǒng)His標(biāo)簽純化、排除引入金屬離子風(fēng)險(xiǎn)
4.嚴(yán)格的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)毒水平低，確保單位酶活的準(zhǔn)確性以及批次間穩(wěn)定性
全能核酸酶應(yīng)用條件：
全能核酸酶的酶活會(huì)受到多種因素的影響（例如溫度、pH、離子強(qiáng)度等），故用量范圍也會(huì)從0.1 U/mL-250 U/mL不等。因此，不同的操作環(huán)境下酶的最佳濃度不同，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)置梯度進(jìn)行最佳條件的摸索。
應(yīng)用實(shí)例：
1.樣品：狂犬病毒濃縮液
處理?xiàng)l件:核酸酶濃度50~90U/ml ,
37 ℃處理 2 h,轉(zhuǎn)入18 ~ 26 ℃處理 6h
2.樣品：狂犬病病毒濃縮液
處理?xiàng)l件：25、50和100 U/ml，37℃
3.樣品：流感病毒濃縮液
處理?xiàng)l件：10 U/mL，37℃
參考文獻(xiàn)
[1] 崔燕平. 非限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)狂犬病疫苗中Vero細(xì)胞DNA的去除作用[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, v.27(04):444-447.
[2] 劉杰,劉輝,楊會(huì)強(qiáng),康莊,孫艷,毛川成,何敏,李玉華.多種方法結(jié)合去除凍干人用狂犬病疫苗中Vero細(xì)胞殘留DNA[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2013,26(12):1827-1830.
[3] 阮朝列,施錦麗,李衛(wèi)東等.Benzonase核酸酶在Vero細(xì)胞流感病毒滅活疫苗中的應(yīng)用研究[J].病毒學(xué)報(bào),2023,39(04):980-990.
