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Luciferase報告基因系統(tǒng)是一種生物發(fā)光檢測系統(tǒng)，主要用于檢測基因的表達(dá)水平。它以熒光素（luciferin）為底物，通過檢測熒光素酶（luciferase）的活性來反映基因的表達(dá)水平。

在Luciferase報告基因系統(tǒng)中，熒光素酶可以催化熒光素氧化成氧化熒光素，在這個氧化過程中會發(fā)出生物熒光。這種熒光可以通過熒光測定儀或液閃測定儀進(jìn)行測定。由于熒光素酶具有出色的靈敏度、使用方便且可定量檢測等優(yōu)點(diǎn)，Luciferase報告基因系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的檢測。

Luciferase報告基因系統(tǒng)的應(yīng)用場景包括啟動子與轉(zhuǎn)錄因子互作檢測、藥物篩選、基因治療以及病毒載體的研究等。通過Luciferase報告基因系統(tǒng)可以快速、準(zhǔn)確地檢測基因的表達(dá)水平，有助于深入了解基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為生物醫(yī)學(xué)研究提供有力支持，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū) DNA 相互作用的一種檢測方法。

實(shí)驗(yàn)原理：

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件。轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)通過檢測熒光素酶的活性來反映基因的表達(dá)水平。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合后，可以激活或抑制熒光素酶的表達(dá)，從而影響熒光素酶的活性。通過比較不同條件或不同處理下熒光素酶的活性，可以了解轉(zhuǎn)錄因子與靶啟動子中的特異順序的結(jié)合情況，進(jìn)一步揭示基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。

原理簡述：

（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報告基因質(zhì)粒，如 pGL3-basic 等。

（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1、實(shí)驗(yàn)第一天，消化并接種細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇合適的細(xì)胞）于 35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，置于 5％ CO2、飽和濕度的 37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

2、等細(xì)胞密度達(dá)到70％時用 Luciferase 報告基因質(zhì)粒、LacZ 的表達(dá)質(zhì)粒及其 它質(zhì)粒（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)選擇轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000 等均可）。

3、轉(zhuǎn)染 24－36 小時后，吸去培養(yǎng)液，用冰冷的 PBS 洗滌細(xì)胞。注：熒光酶的酶促反應(yīng)會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在收集細(xì)胞前應(yīng)充分洗 滌除去含鈣介質(zhì)。

4、在每個培養(yǎng)皿中加入 350 μl 預(yù)冷的 harvest buffer，于 4℃ 或冰上放置 10 min 裂解細(xì)胞。

5、在細(xì)胞裂解期間，準(zhǔn)備足量的1.5 mL 微量離心管，將 ATP buffer 與 luciferin buffer 以 1：3.6 比例混合成反應(yīng)液后分裝，每管 100 μl。

6、依次取等體積的細(xì)胞裂解液（100 μl）至步驟 5 中的離心管中，迅速混勻，在 發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應(yīng)會迅速衰減，將細(xì)胞裂解液加入反應(yīng)液后 5 秒內(nèi)必須讀取吸光值。

7、確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。

8、取剩余裂解液測定 LacZ 的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。

9、用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。

注意事項(xiàng)：

1、為取得最佳測定效果，在用單管的熒光測定儀測定時，樣品和測定試劑混合后到測 定前的時間應(yīng)盡量控制在相同時間內(nèi)，例如 30 秒內(nèi)。

2、由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。

3、為保證熒光素酶檢測試劑的穩(wěn)定性，可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以避免 反復(fù)凍融和長時間暴露于室溫。一般來說，如果不分裝使用三次(期間凍融三次)，對測定結(jié) 果無明顯影響。

4、樣品和測定試劑混合后，必須等待 1-2 秒，再進(jìn)行測定。測定時間通常為 10 秒，根 據(jù)情況也可以測定更長或更短時間，但是同一批樣品最好使用相同的測定時間。

5、為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)細(xì)胞時效率的差異而帶來的誤差，可以同時轉(zhuǎn)入 Renilla 熒光素酶 的報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進(jìn)行檢測;也可以同時轉(zhuǎn)入 β-半乳糖甘酶報告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參，然后采用β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒進(jìn)行檢 測。采用熒光素酶報告基因檢測試劑盒中的報告基因細(xì)胞裂解液裂解獲得的樣品，可以直接 用于β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒中的測定。

逐典螢光素酶報告基因

針對報告基因檢測不同的側(cè)重需求，逐典推出了3種檢測系統(tǒng)。

逐典螢光素酶報告基因特點(diǎn)：

1. 檢測靈敏度高，信號穩(wěn)定性好

HEK293-NFK B-LUC細(xì)胞加入梯度稀釋的TNF 在37C、5%CO條件下刺激6小時后,分別用增強(qiáng)型、超敏型、穩(wěn)定型檢測試劑進(jìn)行信號檢測。

2. 操作方便

僅需將底物和螢光素酶檢測緩沖液混合后直接加入到細(xì)胞即可。

3. 穩(wěn)定性好

同時在10次反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)中，逐典全系列報告基因檢測試劑盒顯示出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。