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體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)&藥理學(xué)研究

抗腫瘤藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)

抗腫瘤藥物藥效學(xué)評(píng)價(jià)是小動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)的基礎(chǔ)應(yīng)用之一，利用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，并移植入動(dòng)物體內(nèi)建立腫瘤疾病動(dòng)物模型，給藥后應(yīng)用小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)觀測(cè)腫瘤光學(xué)信號(hào)隨時(shí)間的變化情況，進(jìn)而評(píng)價(jià)不同藥物、特定的給藥途徑、時(shí)間、劑量等給藥策略對(duì)于腫瘤的治療效果，如下圖就利用小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)評(píng)價(jià)了PD-0332991(PD-991)、阿瓦斯?。ˋvastin）、多西他賽（docetaxel，TXT）的抗腫瘤效果。

利用螢火蟲熒光素酶標(biāo)記MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞株，將細(xì)胞注入小鼠腎包膜下構(gòu)建腎包膜腫瘤模型，進(jìn)而對(duì)3種不同藥物或不同劑量的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。（A,C）應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測(cè)3種藥物對(duì)腎包膜乳腺癌移植瘤的治療效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對(duì)腫瘤的生長抑制效果好；（B,D）應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)長期觀測(cè)3種藥物對(duì)腎包膜乳腺癌移植瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑制效果，并進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示30 mg/kg Docetaxel（TXT）對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制效果好。

Zhang et al.,Clin Cancer Res.2009;15(1):238-46.

利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)的另一優(yōu)勢(shì)在于，可以明確判斷藥物是否有效殺死腫瘤活細(xì)胞。這是由于生物發(fā)光的原理是基于活細(xì)胞環(huán)境的酶促反應(yīng)，因此，能夠發(fā)光的細(xì)胞必定是具有活性的。下圖所示為輝瑞公司抗腫瘤藥物Sutent的部分研究結(jié)果，研究人員首先利用卡尺測(cè)量腫瘤體積的方法觀測(cè)該藥物對(duì)于腫瘤的生長抑制情況，發(fā)現(xiàn)該藥物能夠延緩腫瘤的生長，但體積測(cè)量數(shù)據(jù)顯示腫瘤并未變小，研究人員隨后利用生物發(fā)光成像技術(shù)進(jìn)行觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)給藥一定時(shí)間后腫瘤光學(xué)信號(hào)顯著降低，說明該藥物對(duì)腫瘤活性細(xì)胞確實(shí)具有殺傷作用，同時(shí)說明單獨(dú)依靠腫瘤體積測(cè)量的方式無法準(zhǔn)確真實(shí)反映藥物治療效果。憑借活體光學(xué)成像的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Sutent得以順利通過FDA的認(rèn)證。

IVIS Lumina III小動(dòng)物光學(xué)活體成像系統(tǒng)

該系統(tǒng)進(jìn)一步優(yōu)化了熒光二維成像性能，將濾光片標(biāo)準(zhǔn)配置數(shù)量增加至26個(gè)，引入了作為熒光多光譜成像金標(biāo)準(zhǔn)的純光譜分析技術(shù)（CPS），使得Lumina III成為同時(shí)擁有生物發(fā)光及熒光二維成像金標(biāo)準(zhǔn)的高性能活體成像平臺(tái)。

• 高靈敏度生物發(fā)光二維成像

• 高性能熒光二維成像,配備高品質(zhì)濾光片及光譜分離算法，可實(shí)現(xiàn)自發(fā)熒光扣除及多探針成像

• 生物發(fā)光及熒光成像模式聯(lián)合使用

• 基于切倫科夫輻射原理的放射性同位素成像

D-螢光素鉀鹽

來自逐典的D-螢光素是常用和多功能的生物發(fā)光底物。利用熒光素基因標(biāo)記細(xì)胞，注射熒光素底物后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的細(xì)胞的生長狀況與藥物使用效果。

小動(dòng)物活體光學(xué)成像實(shí)驗(yàn)流程，主要分為：

1，選擇合適的熒光素酶；

2，進(jìn)行載體構(gòu)建

3，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系；

4，細(xì)胞注射動(dòng)物；

5，注射底物；

6，進(jìn)行活體成像

螢火蟲螢光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞株的構(gòu)建可以采用電轉(zhuǎn)染方式。

Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)系統(tǒng)

Nucleofector技術(shù)是—種基于通過施加電脈沖在細(xì)胞膜中瞬間產(chǎn)生小孔，綜合各種Nucleofector嚴(yán)程序和細(xì)胞類型特異性電轉(zhuǎn)試劑，使核酸底物不僅可以輸送到細(xì)胞質(zhì)，還可以通過核膜進(jìn)入細(xì)胞核。這使得細(xì)胞最高轉(zhuǎn)染效率可達(dá)99%，并使轉(zhuǎn)染成功不依賴千細(xì)胞的增殖分裂。無論是原代細(xì)胞、干細(xì)胞、還是細(xì)胞系，它每次都可重復(fù)出很高的轉(zhuǎn)染效率，更高效篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞珠。

藥物分布靶向研究

除了在藥效學(xué)中的應(yīng)用，小動(dòng)物活體光學(xué)成像也廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)靶向、分布及代謝的研究。與藥效學(xué)中的應(yīng)用不同，此類應(yīng)用是以藥物為直接觀測(cè)對(duì)象，因此標(biāo)記方式通常是利用熒光探針直接標(biāo)記藥物本身，通過追蹤熒光信號(hào)而反映藥物在體內(nèi)的分布情況。如在研究抗體或多肽類藥物是否能夠有效靶向腫瘤的實(shí)驗(yàn)中，可以利用熒光染料通過化學(xué)鍵的結(jié)合標(biāo)記目標(biāo)抗體或多肽，經(jīng)尾靜脈注射后，利用小動(dòng)物活體光學(xué)成像系統(tǒng)觀測(cè)上述標(biāo)記對(duì)象的腫瘤靶向性，如下圖：

上圖：利用VivoTag 645熒光染料標(biāo)記抗癌藥物曲妥珠單抗(Trastuzumab)，尾靜脈注入攜帶HER2陽性人卵巢癌SKOV3的SCID小鼠體內(nèi)，通過熒光成像觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)藥物對(duì)腫瘤的靶向情況（左上圖后三列），腫瘤本身已被熒光素酶標(biāo)記而通過生物發(fā)光成像（左上圖最左列），右上圖為熒光定量分析結(jié)果，標(biāo)明曲妥珠單抗對(duì)HER2陽性的人卵巢癌SKOV3具有良好靶向性。

在研究藥物靶向的同時(shí)，了解不同時(shí)間點(diǎn)藥物在動(dòng)物體各個(gè)器官的分布及最終代謝情況同樣。Revvity小動(dòng)物活體熒光斷層成像系統(tǒng)可以很好的滿足此類應(yīng)用需求，能夠?qū)晒鈽?biāo)記的藥物在深層器官的分布進(jìn)行斷層掃描及三維重建，獲得真實(shí)準(zhǔn)確的三維定量數(shù)據(jù)，進(jìn)而對(duì)藥物的體內(nèi)分布代謝情況作出正確分析。如下圖：

上圖左：利用FMT 成像系統(tǒng)觀測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)熒光染料VivioTag 680 標(biāo)記的BSA 在小鼠不同器官的分布； 上圖右：不同時(shí)間點(diǎn)不同器官BSA 分布的定量結(jié)果。

Revvity小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)Spectrum產(chǎn)品系列能夠進(jìn)行生物發(fā)光和熒光的三維重構(gòu)成像，從而更為有效地提供信號(hào)的深度、大小和精確定量的信息，更為嚴(yán)謹(jǐn)、全面地觀察小動(dòng)物體內(nèi)生物學(xué)反應(yīng)，完成小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)從二維到三維成像、從相對(duì)定量到精確定量的飛躍。IVIS Spectrum CT同時(shí)具備功能性及結(jié)構(gòu)性成像功能，使研究人員能夠更全面的了解活體動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象。

功能性成像包括:

(1)三維生物發(fā)光成像;

(2)三維熒光成像;

(3)三維切倫科夫成像:

結(jié)構(gòu)成像包括:

(1)活體動(dòng)物斷層掃描功能;

(2)影像重建功能;

(3)適合進(jìn)行高通量成像;

(4)熒光多光譜成像;

CAR-T細(xì)胞藥物毒性研究

CAR-T細(xì)胞是通過識(shí)別并靶向腫瘤細(xì)胞表面抗原從而殺死腫瘤細(xì)胞。遺憾的是，CAR-T細(xì)胞針對(duì)的靶抗原多為腫瘤相關(guān)抗原（TAA），并非腫瘤細(xì)胞所的，在正常組織上也存在不同程度的表達(dá)。此時(shí)對(duì)靶抗原親和力和殺傷能力強(qiáng)的CAR-T細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)攻擊正常組織，造成組織器官的損傷。

在FDA發(fā)布的《細(xì)胞治療臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南》中也提到， 需要使用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型來預(yù)測(cè)臨床反應(yīng)。 然而多數(shù)情況下，因?yàn)榘锌乖诳缥锓N反應(yīng)中存在差異性，目前用于CAR-T藥理試驗(yàn)的動(dòng)物模型，并不符合這一標(biāo)準(zhǔn)。因此，臨床前動(dòng)物研究很難預(yù)測(cè)臨床潛在的不良反應(yīng)，同時(shí)會(huì)造成一種安全的假象。因此，急需一種在正常組織中表達(dá)人類靶點(diǎn)的動(dòng)物模型， 來預(yù)測(cè)脫靶毒性，并提高免疫治療的安全性。

為了解決這個(gè)問題，Carl H. June教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種小鼠模型，該模型能夠在正常肝組織上穩(wěn)定可調(diào)的表達(dá)人類靶抗原。并以表達(dá)人表皮生長因子受體-2（Her2）為例展開了研究，同時(shí)比較了不同親和力CAR-T 細(xì)胞的抗腫瘤效果及毒性。相關(guān)結(jié)果發(fā)表在《JCI Insight.》期刊上。

研究人員設(shè)計(jì)了肝臟高/低抗原表達(dá)的兩組小鼠，注射相對(duì)高/低親和力的CAR-T細(xì)胞，隨后通過體重、血清樣本、臨床毒性信號(hào)及活體成像信號(hào)等指標(biāo)來評(píng)價(jià)不同親和力CAR-T的毒性反應(yīng)。結(jié)果顯示，在肝臟低Her-2表達(dá)的小鼠中，高親和力的CAR-T療法是非致死的，而異種排斥反應(yīng)才是主因(下圖B)。肝臟低表達(dá)小鼠的毒性降低，死亡率降低(下圖C)，親和調(diào)節(jié)的CAR-T的死亡率沒有顯著差異(圖C)，但高親和力CAR-T細(xì)胞更容易造成肝臟損傷（下圖D）及體重的降低（下圖E）。通過IVIS生物發(fā)光成像評(píng)估兩種親和力CAR-T細(xì)胞的豐度差異，結(jié)果顯示在陰性對(duì)照小鼠在注射T細(xì)胞后的前2周內(nèi)，CAR-T細(xì)胞的數(shù)量保持不變，表明缺乏抗原依賴性激活。在低抗原表達(dá)小鼠中，抗原識(shí)別時(shí)間延長，高親和力組保持激活時(shí)間更長?？偟膩碚f，低親和力 CAR-T細(xì)胞在該動(dòng)物模型中能夠更好地區(qū)分低抗原密度和高抗原密度組織，表現(xiàn)出更好的安全性。

CAR-T非腫瘤靶向引起毒性評(píng)價(jià)