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G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）參與許多細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前，超過45%的藥物都以GPCR為靶點(diǎn)。確定GPCR細(xì)胞活性，可以通過監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化來實(shí)現(xiàn)。Ca2+直接或間接調(diào)節(jié)包括基因表達(dá)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和收縮在內(nèi)的許多生理過程。諸如蛋白激酶C（PKC）、轉(zhuǎn)錄因子NFAT或鈣調(diào)磷酸酶等多種蛋白質(zhì)均受Ca2+濃度變化的調(diào)節(jié)。在此，我們介紹了使用VICTOR™ Nivo多模式讀板儀以水母發(fā)光蛋白生物發(fā)光檢測方法，分析在GPCR刺激或抑制下的快速胞內(nèi)Ca2+信號。

化學(xué)發(fā)光法檢測原理是基于GPCR的激活引起細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度增加：當(dāng)GPCR被激動(dòng)劑激活后，Gαq亞基從G蛋白解離并誘導(dǎo)肌醇三磷酸濃度增加；從而引起鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入。該檢測采用穩(wěn)定表達(dá)人組胺H1 GPCR和水母發(fā)光蛋白的CHO細(xì)胞系進(jìn)行。已知的激動(dòng)劑和拮抗劑用于受體刺激。檢測中，細(xì)胞與腔腸素-h一起孵育。腔腸素-h穿透細(xì)胞膜并在氧氣存在下與高表達(dá)的水母發(fā)光蛋白結(jié)合，導(dǎo)致后者重組。在三個(gè)Ca2+離子的作用下，水母發(fā)光蛋白分子將腔腸素-h底物氧化為腔腸酰胺，釋放二氧化碳并在469nm處產(chǎn)生具有峰值的閃光，通過VICTOR Nivo檢測。

由于GPCR激活后細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加且相應(yīng)的閃光產(chǎn)生速度非常快，因此該檢測需要極快速的測量響應(yīng)。VICTOR Nivo讀板儀的分液器可以滿足這一需求，它可以在進(jìn)樣后0.1秒從微孔板底部檢測發(fā)光信號。

結(jié)果與討論

陽性化合物Digitonin量效關(guān)系

VICTOR Nivo系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)檢測模式在添加陽性對照Digitonin后精確測量隨時(shí)間變化的發(fā)光信號（圖2）。結(jié)果表明，Digitonin濃度越低，產(chǎn)生光信號延遲越長，而最高濃度的Digitonin能最快產(chǎn)生光信號。這顯示了化合物濃度對Ca2+和信號產(chǎn)生所需時(shí)間的影響VICTOR Nivo對發(fā)光信號曲線的快速動(dòng)力學(xué)測量提高了在不同化合物濃度下化合物效應(yīng)檢測的準(zhǔn)確性，因此能夠精確計(jì)算劑量反應(yīng)曲線。對Digitonin動(dòng)力學(xué)測量中產(chǎn)生的信號進(jìn)行整合，并計(jì)算曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應(yīng)曲線。這證實(shí)Digitonin能作為水母發(fā)光蛋白檢測中的對照品。

細(xì)胞數(shù)滴定

為了確定H1/水母發(fā)光蛋白細(xì)胞的檢測窗口，進(jìn)行了細(xì)胞數(shù)滴定。不同數(shù)量的細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)光信號正相關(guān)不同的Ca2+濃度。Histamine作為H1受體的標(biāo)準(zhǔn)激動(dòng)劑。結(jié)果表明，當(dāng)細(xì)胞數(shù)約80000-100000個(gè)/孔時(shí)，發(fā)光信號達(dá)到飽和。此外，在不同細(xì)胞密度下，光信號的峰值都是同時(shí)產(chǎn)生的。因此，以20000個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

在每孔不同數(shù)量的細(xì)胞中加入組胺（1.56μM）產(chǎn)生的發(fā)光信號。

使用組胺優(yōu)化激動(dòng)劑信號檢測

使用優(yōu)化的細(xì)胞數(shù)，在H1受體受到組胺刺激后記錄激動(dòng)劑檢測的動(dòng)力學(xué)測量結(jié)果。

使用20000個(gè)細(xì)胞/孔，在H1受體受到組胺刺激后產(chǎn)生的Ca2+信號反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。

與Digitonin類似，研究表明，組胺濃度越低，產(chǎn)生閃光越滯后，而最高濃度的組胺會(huì)立即引發(fā)光信號。對H1 GPCR動(dòng)力學(xué)測量中產(chǎn)生的信號進(jìn)行整合，并繪制曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應(yīng)曲線。計(jì)算得出384孔板實(shí)驗(yàn)條件下組胺的EC50為143.4nM。與先前發(fā)表的數(shù)據(jù)一致。

通過在96孔板格式中重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該方法的普適性。108nM組胺的EC50與384孔板實(shí)驗(yàn)中計(jì)算的143nM EC50在同一范圍內(nèi)，表明該方法適用于不同類型的微孔板。

96孔板格式中H1受體刺激后的激動(dòng)劑檢測。A：在H1受體受到組胺刺激后產(chǎn)生的Ca2+信號反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。B：組胺激動(dòng)劑刺激H1受體后的劑量-反應(yīng)曲線。

抑制劑信號檢測

為了證明H1-水母發(fā)光蛋白檢測法也可用于受體抑制劑檢測，在激動(dòng)劑檢測實(shí)驗(yàn)中測定的EC80濃度下，用Triprolidine（曲普利啶）對組胺進(jìn)行了拮抗劑檢測。繪制曲線下面積的平均值，以生成劑量-反應(yīng)曲線，計(jì)算Triprolidine的IC50為12.28nM。

EC80濃度下通過曲普利啶拮抗劑對組胺激動(dòng)劑進(jìn)行檢測的H1受體抑制的劑量-反應(yīng)曲線。

結(jié)論

本研究描述了水母發(fā)光蛋白快速發(fā)光檢測法的優(yōu)化，以檢測激動(dòng)劑和拮抗劑對Ca2+偶聯(lián)的組胺H1 GPCR的影響。該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差低，板間差異性小，再現(xiàn)性良好。VICTOR Nivo多模式讀板儀與分液器結(jié)合非常適用于這類檢測。使用預(yù)先設(shè)定的方案，利用孔內(nèi)信號發(fā)生動(dòng)力學(xué)測量和板底部快速信號檢測，結(jié)合VICTOR Niv的分液器，為該檢測提供了靈活性。

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