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Revvity小動物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在眾多應(yīng)用領(lǐng)域中，干細(xì)胞研究是活體光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用 熱點之一。在活體光學(xué)成像實驗中，常用于干細(xì)胞光學(xué)標(biāo)記的方法包括：1、利用螢火 蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）作為報告基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外轉(zhuǎn)染干細(xì)胞；2、 通過親脂性熒光染料直接標(biāo)記干細(xì)胞；3、從已構(gòu)建好的生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物中提取干 細(xì)胞，所提取干細(xì)胞即具備生物發(fā)光特性?？傮w來說，應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進 行干細(xì)胞研究主要集中于以下幾個方面：1、監(jiān)測干細(xì)胞的移植、存活和增殖；2、示蹤 干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和遷移；3、多能誘導(dǎo)干細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞等新興研究。下面結(jié)合 一些具體實例進行闡述：

一.監(jiān)測干細(xì)胞的移植、存活和增殖

干細(xì)胞移植在治療心肌缺血、脊髓損傷、關(guān)節(jié)炎等多種疾病中發(fā)揮重要作用。但是 迄今為止，科學(xué)家對干細(xì)胞在體內(nèi)的存活時間和增殖規(guī)律并未了解，而缺少有效的 技術(shù)手段是其中一個重要限制因素。活體光學(xué)成像技術(shù)可以長期連續(xù)監(jiān)測干細(xì)胞在活體 動物體內(nèi)的存活及增殖規(guī)律，為干細(xì)胞的研究提供了全新的技術(shù)支持。以下為應(yīng)用生物 發(fā)光成像技術(shù)觀測干細(xì)胞在活體動物體內(nèi)存活和增殖的具體實例：

造血干細(xì)胞移植是現(xiàn)代生命科學(xué)的重大突破，通過移植造血干細(xì)胞可以治療惡性 血液病，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等多種致死性疾病。之前對于造血干細(xì)胞的 異體移植研究主要依靠流式細(xì)胞儀分析從處死的受體動物中提取的骨髓。這種方法雖然 能夠準(zhǔn)確測量造血干細(xì)胞的移植存活率，但存在諸多缺陷：如需處死大批實驗動物；無 法反映除骨髓之外其他部位發(fā)生的造血重組情況；數(shù)據(jù)獲取只局限于處死動物后的單一 時間點，無法對同一個體的移植情況進行連續(xù)縱向觀測。生物發(fā)光成像技術(shù)很好的解決 了上述問題。發(fā)表于2003年Blood雜志上的一篇文獻利用了生物發(fā)光技術(shù)進行干 細(xì)胞異體移植的研究。作者觀察了不同造血干細(xì)胞（CD34+，CD34+CD38-）移植后，在 體內(nèi)表現(xiàn)出的不同增值規(guī)律：前者在移植8天后快速增殖，22天后細(xì)胞數(shù)量急劇下降； 后者移植后一直處于增殖狀態(tài)。研究者認(rèn)為該技術(shù)是研究干細(xì)胞異體移植后的遷移和增 殖規(guī)律的有力工具，同時是研究不同細(xì)胞群體在體內(nèi)增殖不同表現(xiàn)的。

將生物發(fā)光標(biāo)記的人造血干細(xì)胞 CD34+(A) 或CD34+CD38-(B)經(jīng)尾 靜脈移植入NOD/SCID小鼠體內(nèi)， 應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)長時間觀測上 述細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的存活及增殖 情況。

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（Adultmuscle satellite cells）是骨骼肌中位于肌細(xì)胞膜和基膜之間 的具有增殖分化潛力的肌源性細(xì)胞。它們在一般情況下處于靜息狀態(tài)，當(dāng)被激活后， 具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌細(xì)胞的能力。因此，肌肉衛(wèi)星細(xì)胞被認(rèn)為是一 種干細(xì)胞，但衛(wèi)星細(xì)胞群的混合性質(zhì)意味著它們的干細(xì)胞身份難以證明。發(fā)表于2008 年Nature 上的一篇文獻通過利用生物發(fā)光成像技術(shù)證實衛(wèi)星細(xì)胞的確是干細(xì)胞、能夠 自我更新，從而澄清了相關(guān)問題。研究者將生物發(fā)光標(biāo)記的單個肌肉衛(wèi)星細(xì)胞移植入 NOD/SCID 小鼠脛骨前肌中，4周后利用IVIS成像系統(tǒng)進行觀測，發(fā)現(xiàn)它能夠存活并 大量增殖，而且可以被再次移植。

應(yīng)用干細(xì)胞進行疾病治療的一個重要前提是能夠成功接種干細(xì)胞，并且干細(xì)胞移植 后在受體動物體內(nèi)能夠穩(wěn)定存活。為此，科研人員一直致力于通過各種途徑提高干細(xì)胞 的在體存活率

在利用干細(xì)胞修復(fù)梗阻心肌的實驗中，通常是將相互離散的干細(xì)胞直接注入心肌 內(nèi)，這會很容易造成相互離散的干細(xì)胞由于注射點滲血或心臟收縮而被排出，以及射入 細(xì)胞的急性死亡，都會導(dǎo)致心肌內(nèi)干細(xì)胞的存留及存活率下降。2011年Biomaterials上 一篇文獻針對上述問題提出了解決方案。研究者摒棄了直接將相互離散的干細(xì)胞注入心 肌的方式，而是首先利用甲基纖維素水凝膠對生物發(fā)光標(biāo)記的人羊水干細(xì)胞（hAFSC） 進行體外培養(yǎng)，使相互離散的干細(xì)胞形成球面對稱的細(xì)胞體，然后再將細(xì)胞體注入心肌。 結(jié)果顯示，與直接注射離散細(xì)胞相比，注射細(xì)胞體能夠有效提高干細(xì)胞的移植率和存活 率。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因是細(xì)胞體相對于離散細(xì)胞具有更有效的物理體積，因而更容易 存留于心肌間隙，一旦進入心肌間隙，細(xì)胞體中富集的內(nèi)源性胞外基質(zhì)和粘附分子便可 提供良好的微環(huán)境使移植細(xì)胞存活于受體中。

另一篇文獻報道了利用生物材料提高干細(xì)胞的移植存活率。研究者將人工基質(zhì)膠 （Matrigel）、膠原蛋白（Collagen 1）、肽段水凝膠（Puramatrix）及上述三種物質(zhì)的混 合物分別與生物發(fā)光標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞混合接種于無胸腺裸鼠背部皮下，利用 IVIS 成像系統(tǒng)長時間觀測三種生物材料對干細(xì)胞體內(nèi)存活的影響。結(jié)果顯示，人工基質(zhì) 膠能夠明顯提高干細(xì)胞的移植存活率。原因可能是基質(zhì)膠中的基膜蛋白能夠釋放各種生 長因子，為細(xì)胞的增殖分化提供良好的微環(huán)境，同時基質(zhì)膠本身為細(xì)胞提供了支撐架構(gòu)。

二.示蹤干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和遷移

干細(xì)胞移植后，活體示蹤干細(xì)胞的分布和遷徙具有重要意義。通過示蹤，不僅可以 直觀地了解其在體內(nèi)的分布，而且可以追蹤到其體內(nèi)的分化轉(zhuǎn)歸及調(diào)控機制。核素成像、 磁共振成像、光學(xué)成像等分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展使干細(xì)胞活體示蹤成為可能。但通過放 射性核素或磁性顆粒標(biāo)記干細(xì)胞進行活體示蹤時，由于核素的快速衰減或磁性顆粒無法 隨細(xì)胞分裂而保留等缺陷，導(dǎo)致無法在體內(nèi)對干細(xì)胞進行長期示蹤。而生物發(fā)光成像技 術(shù)是利用熒光素酶基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干細(xì)胞，報告基因不隨干細(xì)胞的分裂或分化而丟失，因 此，利用這種技術(shù)可以長期穩(wěn)定地觀測干細(xì)胞在體內(nèi)的分布和遷移。

2007 年Stem Cell 上的一篇文獻即利用生物發(fā)光成像技術(shù)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向 遷移至受損心臟進行了長期觀測。研究者從生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠中提取獲得具有生物發(fā) 光特性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后經(jīng)尾靜脈注射入心臟缺血的同品系小鼠體內(nèi)，利用 IVIS 成像系統(tǒng)對干細(xì)胞的分布和遷移進行長達28天的活體觀測，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞會特異性 遷移至受損心臟并存留于心肌中發(fā)揮修復(fù)功能。

神經(jīng)干細(xì)胞增殖及遷移的缺陷是造成帕金森氏病等神經(jīng)退行性疾病的主要原因。神 經(jīng)干細(xì)胞起源于側(cè)腦室外側(cè)壁的室管膜下層區(qū)域（subventricular zone，SVZ）與海馬齒 狀回（dentate gyrus，DG），之后通過嘴側(cè)遷移流（rostral migratory stream，RMS）到 達嗅球（olfactory bulb，OB），進一步分化為中樞神經(jīng)細(xì)胞并融入現(xiàn)有的神經(jīng)通路。2008 年發(fā)表于Stem Cell上的一篇文獻報道了利用生物發(fā)光成像技術(shù)觀測神經(jīng)干細(xì)胞的上述 遷移情況。如下圖所示：

應(yīng)用干細(xì)胞治療癌癥是腫瘤治療的新方法。進行干細(xì)胞腫瘤治療的前提是干細(xì)胞移 植后能夠靶向遷移至腫瘤細(xì)胞。應(yīng)用活體光學(xué)成像技術(shù)能夠有效觀測干細(xì)胞在活體動物 體內(nèi)對腫瘤的靶向遷移。2009年發(fā)表于Stem Cell上的一篇研究結(jié)果即是一個很好的例 證。研究者分別利用海腎熒光素酶基因（Renilla Luciferase）及螢火蟲熒光素酶基因 （Firefly Luciferase），標(biāo)記鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用IVIS成 像系統(tǒng)觀測經(jīng)尾靜脈移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向乳腺癌腫瘤的情況，如下圖所示：

上述實例描述了應(yīng)用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞而對其在體內(nèi)的分布遷移進行長期 示蹤，另一種用于標(biāo)記干細(xì)胞的方式是過親脂性熒光染料（如DiD、DiR）直接標(biāo)記干 細(xì)胞。相對于前種方式，應(yīng)用熒光標(biāo)記的方式示蹤干細(xì)胞只限于短期觀測，這是因為這 些親脂性熒光染料是通過嵌入細(xì)胞膜而標(biāo)記細(xì)胞，因此無法隨細(xì)胞傳代，并且熒光染料 的發(fā)光強度也會逐漸減弱。但是，應(yīng)用熒光染料進行標(biāo)記，標(biāo)記過程更易于操作，且具 有轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的應(yīng)用潛力。因此，也有不少研究者通過這種方式監(jiān)測干細(xì)胞在體內(nèi)的分布 遷移情況。下述例子中，研究者利用 DiD 親脂性熒光染料標(biāo)記人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （hMSC），將細(xì)胞腹腔注射入經(jīng)抗原誘導(dǎo)而患有關(guān)節(jié)炎的無胸腺大鼠中，應(yīng)用IVIS成 像系統(tǒng)觀測hMSC在體內(nèi)的分布及遷移。結(jié)果顯示，注射后早期，hMSC主要富集于腹 腔，而隨著時間的延長，細(xì)胞逐漸遷移至患有關(guān)節(jié)炎的踝關(guān)節(jié)處。

三.新興研究

活體光學(xué)成像技術(shù)在傳統(tǒng)意義干細(xì)胞的研究中已得到廣泛應(yīng)用。隨著干細(xì)胞研究程 度的深入，研究者已開始將該技術(shù)應(yīng)用于干細(xì)胞的一些新興研究領(lǐng)域，如誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）及腫瘤干細(xì)胞（Cancer/Tumor Stem Cell， CSC/TSC）的研究。

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞研究

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞最初是日本科學(xué)家山中申彌（Shinya Yamanaka）于2006年利用 病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的組合引入小鼠成纖維細(xì)胞中， 使其重編程而得到的類似胚胎干細(xì)胞的一種細(xì)胞類型。雖然將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞應(yīng)用于 臨床治療仍存在諸多不確定因素（如致癌副作用、自體免疫排斥等），但相對于在胚胎 干細(xì)胞應(yīng)用中產(chǎn)生的倫理爭議，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞由于是對成體細(xì)胞進行重編程而獲 得，因此不存在這方面的問題，使其應(yīng)用前景更為光明。

近年來，研究者已陸續(xù)開始利用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進行誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的 相關(guān)研究。發(fā)表于2009年Circulation 的一篇文獻報道，將經(jīng)熒光素酶標(biāo)記的由小鼠成 纖維細(xì)胞誘導(dǎo)獲取的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，移植入免疫缺陷型裸鼠或具有免疫活性的同種 異體小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)在后者中不會形成畸胎瘤。進一步的研究顯示將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 移植入發(fā)生急性心肌梗塞的具有免疫活性的同種異體小鼠心臟后，細(xì)胞的發(fā)展不會導(dǎo)致 畸胎瘤的形成，能夠穩(wěn)定存活，并能修復(fù)受損的心臟。

另一篇發(fā)表于2010年P(guān)NAS的文獻報道了應(yīng)用IVIS成像系統(tǒng)觀測由iPS形成的神 經(jīng)球在脊髓損傷小鼠體內(nèi)的移植、存活和修復(fù)作用。

腫瘤干細(xì)胞研究

腫瘤干細(xì)胞研究 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腫瘤是由體細(xì)胞突變而成，每個腫瘤細(xì)胞都可以無限制地生長，但 這無法解釋腫瘤細(xì)胞似乎具有無限的生命力以及并非所有腫瘤細(xì)胞都能無限制生長的 現(xiàn)象。而腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的特點與干細(xì)胞的基本特性十分相似，因此，有學(xué) 者提出腫瘤干細(xì)胞的理論，認(rèn)為腫瘤中一小部分細(xì)胞具有自我更新、增殖和分化的潛能， 雖然數(shù)量少，卻在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。從本質(zhì)上講，腫瘤 干細(xì)胞通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細(xì)胞群的生命力；腫瘤干細(xì)胞的運動和遷徙 能力又使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為可能；腫瘤干細(xì)胞可以長時間處于休眠狀態(tài)并具有多種耐 藥分子而對殺傷腫瘤細(xì)胞的外界理化因素不敏感，因此腫瘤往往在常規(guī)治療方法消滅大 部分普通腫瘤細(xì)胞后一段時間復(fù)發(fā)。這一理論為我們重新認(rèn)識腫瘤的起源和本質(zhì)，以及 臨床腫瘤治療提供了新的方向。

近年來，研究者已陸續(xù)開始利用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進行腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)研 究。在腫瘤干細(xì)胞的鑒定方面，研究者可利用活體光學(xué)成像技術(shù)在活體動物水平觀測某 些細(xì)胞的致瘤性，以確定該種細(xì)胞是否具備腫瘤干細(xì)胞的特性。如在2010年的一篇文 獻報道中，研究者利用熒光素酶通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式標(biāo)記了乳腺癌細(xì)胞株HCC1954， 并利用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離出帶有不同細(xì)胞表面標(biāo)識物 CD24-/low/CD44+及 CD24+/CD44+的兩種細(xì)胞群，而CD24-/low/CD44+被報道存在于多種乳腺癌干細(xì)胞表面， 因此，研究者進一步將兩種細(xì)胞分別接種于NOD/SICD小鼠身體兩側(cè)的乳腺脂肪墊，利 用IVIS 成像系統(tǒng)觀測它們的致瘤性。結(jié)果顯示，帶有表面標(biāo)識物CD24-/low/CD44+的細(xì) 胞其致瘤性明顯高于 CD24+/CD44+細(xì)胞，并且當(dāng)細(xì)胞接種數(shù)量少于 100 個時，只有 CD24-/low/CD44+細(xì)胞具備致瘤性，說明帶有CD24-/low/CD44+的細(xì)胞群中可能富含腫瘤干 細(xì)胞。

傳統(tǒng)的化療藥物主要是通過篩選能殺滅分裂中腫瘤細(xì)胞的化合物，而腫瘤干細(xì)胞理 論認(rèn)為，只要存在腫瘤干細(xì)胞，腫瘤就不可能治愈。所以，腫瘤治療的焦點是殺傷腫瘤 干細(xì)胞。但是腫瘤干細(xì)胞通常處于靜止?fàn)顟B(tài)，只是在增殖時才開始快速分裂產(chǎn)生子細(xì)胞， 所以，按照傳統(tǒng)方法篩選出來的腫瘤治療藥物與殺滅腫瘤干細(xì)胞的要求差異巨大。2011 年發(fā)表于 Cell 的一篇文獻報道了根據(jù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖特性而利用針對性藥物 對腫瘤進行治療。研究者發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖依賴于一氧化氮合成酶 2 （NOS2），而普通神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞或正常神經(jīng)干細(xì)胞的增殖均不依賴NOS2，因此，研 究者設(shè)計出一個專門針對NOS2的抑制劑，此抑制劑能夠很好地穿過血腦屏障進入顱內(nèi) 移植的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，并對熒光素酶標(biāo)記的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長具有明顯抑制效果。同時， 經(jīng)抑制劑處理的神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞其致瘤性也大幅降低。