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細(xì)胞死亡在生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞死亡可以是主動(dòng)調(diào)節(jié)的程序性死亡，也可以由于不可控環(huán)境引發(fā)的細(xì)胞壞死。在程序性死亡的通路中，鐵死亡是一種脂質(zhì)過(guò)氧化依賴(lài)性細(xì)胞死亡形式。在過(guò)去的十年中，鐵死亡已成為一個(gè)高度新興的領(lǐng)域，對(duì)各種疾病的發(fā)生和發(fā)展都有影響。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種類(lèi)型藥物能夠誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生，比如IKE可通過(guò)抑制system xc-、引起谷胱甘肽耗竭、脂質(zhì)過(guò)氧化并誘導(dǎo)鐵死亡。除了發(fā)現(xiàn)很多通過(guò)GXP4關(guān)鍵的信號(hào)分子通路的藥物外，也發(fā)現(xiàn)了GPX4非依賴(lài)性鐵死亡通路的藥物。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多鐵死亡調(diào)節(jié)途徑，轉(zhuǎn)錄和代謝過(guò)程在參與鐵死亡調(diào)節(jié)方面的具體機(jī)制還沒(méi)有得到解釋。
為了發(fā)現(xiàn)鐵死亡的新型細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，研究人員篩選了3684個(gè)具有已知靶點(diǎn)和作用模式的小分子庫(kù)。在用篩選庫(kù)的化合物預(yù)處理 HT-1080 細(xì)胞后，IKE 誘導(dǎo)鐵質(zhì)細(xì)胞死亡。評(píng)估細(xì)胞活力，每種達(dá)到高于閾值活力的化合物視為目標(biāo)化合物。利用瑞孚迪（Revvity）高通量藥物篩選工具搭建的平臺(tái)，將HT1080細(xì)胞接種到CulturPlate 384微孔板中，Sciclone G3液體工作站進(jìn)行細(xì)胞處理和藥物刺激，并利用EnVision 2104多標(biāo)記酶標(biāo)儀檢測(cè)CellTiter-Glo測(cè)定的發(fā)光信號(hào)來(lái)評(píng)價(jià)。
在這16種潛在的鐵死亡抑制劑中，有Turofexorate和 Fexaramine（法尼醇 X 受體激動(dòng)劑），以及已知的鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些目標(biāo)化合物。是否為鐵死亡抑制因子，用相同的實(shí)驗(yàn)方案利用Envision進(jìn)行了10個(gè)劑量反應(yīng)分析，由于缺乏可重復(fù)的功效，又剔除了六種化合物。
為了驗(yàn)證這些化合物是鐵死亡選擇性，對(duì)相關(guān)化合物進(jìn)行了細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡試驗(yàn)。對(duì)于細(xì)胞凋亡測(cè)定，使用星形孢菌素誘導(dǎo)細(xì)胞死亡;壞死性凋亡細(xì)胞死亡是通過(guò) TNF-α、SMAC模擬物L(fēng)CL-16和泛半胱天冬酶抑制劑 Z-VAD-FMK的混合物誘導(dǎo)的。結(jié)果表明除ATT外，選擇的化合物都無(wú)法挽救經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或壞死性凋亡的細(xì)胞，表明它們對(duì)鐵細(xì)胞死亡的選擇性作用。我們還測(cè)試了選擇的鐵死亡抑制化合物對(duì)III類(lèi)鐵死亡誘導(dǎo)劑FIN56的效果的影響。幾乎所有化合物都顯示出對(duì)FIN56誘導(dǎo)的鐵死亡的保護(hù)作用，化合物Turofexorate和fexaramine效果尤為顯著。這些方式都是以相關(guān)藥物誘導(dǎo)后，利用Envision檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞活力。最后也用流式結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。
Turofexorate和Fexaramine是已知的FXR合成激動(dòng)劑，FXR是一種核受體，可作為肝臟、腎臟和小腸中膽汁酸的傳感器。在RSL3和IKE處理的寬濃度范圍內(nèi)，通過(guò)Turofexorate或Fexaramine激活FXR可挽救細(xì)胞免于鐵死亡的細(xì)胞。
同時(shí)，FXR與類(lèi)視黃醇X受體 （RXR） 形成二聚體從而發(fā)揮作用。為了測(cè)試FXR-RXR二聚化是否是實(shí)現(xiàn)抗鐵死亡作用所必需的，我們用鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3或IKE處理HT-1080細(xì)胞，并添加Turofexorate或Fexaramine以挽救細(xì)胞的鐵死亡。此外，我們用RXR拮抗劑HX 531（RXRi）處理細(xì)胞。我們觀察到添加RXR拮抗劑后顯著劑量依賴(lài)性致敏，表明僅激活FXR不足以抑制鐵死亡細(xì)胞死亡，需要FXR-RXR二聚化協(xié)作。以抑制鐵死亡。
為了模擬更接近生理?xiàng)l件，在HT-1080微球體中誘導(dǎo)鐵死亡，并用Turofexorate或Fexaramine處理它們。RSL3誘導(dǎo)的鐵死亡影響了微球的形成。而與FXR激動(dòng)劑的聯(lián)合處理導(dǎo)致完整的球狀體與DMSO或鐵抑素1 處理的對(duì)照相同。利用Operetta高內(nèi)涵圖像分析測(cè)量球體寬度與長(zhǎng)度之比的結(jié)果證實(shí)了鐵死亡誘導(dǎo)球體和藥物抑制鐵死亡球體之間的顯著差異。
后續(xù)為了驗(yàn)證相關(guān)作用機(jī)制，也利用了Envision的光吸收，熒光，化學(xué)發(fā)光等模塊對(duì)相關(guān)藥物的抗氧化，穩(wěn)定性等進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。
最后，分別利用離體原代小鼠肝細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSCs）分化為功能性人肝細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)化合物鐵死亡的重要調(diào)控能力，分別利用酶標(biāo)儀和高內(nèi)涵進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。
總結(jié)
核受體FXR是一種有效的鐵死亡轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過(guò)上調(diào)許多鐵死亡抑制基因來(lái)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡。
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本工作利用瑞孚迪的高通量篩選工具和分子細(xì)胞評(píng)價(jià)系統(tǒng)，詳細(xì)解釋了各種模型內(nèi)與細(xì)胞死亡相關(guān)的多種機(jī)制。
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