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導讀
藥物免疫毒性可以定義為非預期的免疫抑制或免疫調(diào)節(jié)。免疫抑制可能導致宿主對傳染源或腫瘤細胞的抵抗力下降，而免疫增強可能會加劇自身免疫性疾病或過敏反應。藥物誘導的全身免疫激活可導致與細胞因子過度釋放相關(guān)的嚴重反應，也稱為細胞因子風暴。由于免疫系統(tǒng)的功能具有高度的物種特異性，因此很難通過動物研究來預測人類細胞因子的釋放。全血檢測在藥物開中屬于易于操作的體外解決方案。能快速簡單地監(jiān)測人類細胞因子釋放，從而預測藥物的功效和安全性。相比基于PBMC的測定更科學、更便捷，不需要純化和分離細胞。少量血液（<5mL）足以測試多種實驗條件。
研究內(nèi)容
這項研究選擇免疫途徑和相關(guān)激動劑來靶向Toll樣受體途徑、STING途徑或TCR激活途徑。最后通過HTRF定量人IL1β、IL2、IL6、IL8、TNFα和IFNγ。此外，將HTRF數(shù)據(jù)與ELISA參考試劑盒獲得的數(shù)據(jù)進行比較，以評估兩種技術(shù)之間的相關(guān)性。
來自3位不同獻血者的新鮮血液被收集在肝素管中，并且全血樣品均質(zhì)化后在RPMI中稀釋。將化合物分配到96孔板中，然后添加預稀釋的全血樣品。在37°C下孵育過夜，收集上清液，按表1所示稀釋全血上清液。最后使用HTRF或ELISA測量細胞因子。
實驗結(jié)果
01 Toll樣1、2、4、6受體的激活
用HKLM、LPS或酵母聚糖刺激Toll樣受體途徑。下圖顯示了未處理樣品與處理樣品中每種測量細胞因子的濃度。HTRF解決方案能夠測定所有樣品中的基礎(chǔ)細胞因子水平（虛線）以及測量細胞因子分泌的增加。
02 STING通路的激活和T細胞受體途徑的激活
2,3cGAMP是STING途徑的特異性激活劑。激活后的細胞因子分泌譜顯示TNFα、IL1β和IL6顯著增加。相反，IFNα、IL2或IL8沒有顯著反應（下圖）。圖6顯示OKT3/抗CD28刺激全血中的T細胞誘導輕微的IFNγ釋放，但未能誘導任何IL2產(chǎn)生。然而，對照條件PHA或PMA/離子霉素誘導IL2和IFNγ細胞因子的強烈增加。這些數(shù)據(jù)表明OKT3/CD28并沒有產(chǎn)生強烈T細胞特異性反應。
03 HTRF和ELISA檢測之間的相關(guān)性
由于ELISA方法仍然是生物體液中細胞因子測量的傳統(tǒng)常用方法，因此本研究將HTRF獲得的細胞因子濃度與ELISA測定獲得的細胞因子濃度進行比較。來自3個不同供體的全血樣本首先在地塞米松存在/不存在的情況下用R848（TLR 7/8激活）進行刺激。通過HTRF或ELISA進行R848+/-地塞米松處理后IL8釋放的測量，并確定兩種化合物的EC50或IC50。下圖顯示了HTRF和ELISA人IL8測定之間在164個樣品上獲得的相關(guān)性。在這里，研究證明了兩種檢測之間具有非常好的相關(guān)性，相關(guān)值r=0.993，比例偏差為0.77。
然后研究比較了通過HTRF和ELISA在3個不同供體上獲得的R848和地塞米松藥理劑量反應（下圖）。結(jié)果表明，兩種方法測得的R848的EC50值或地塞米松的IC50值也非常接近（見表2）。
隨著免疫腫瘤學或代謝疾病等領(lǐng)域的研究和藥物發(fā)現(xiàn)的快速發(fā)展，監(jiān)測免疫系統(tǒng)對治療的反應比以往任何時候都更加重要。全血檢測是一種用于評估對治療免疫反應簡單而強大的體外工具。HTRF細胞因子檢測具有免洗方案、低樣品消耗和廣泛的動態(tài)范圍，與ELISA相比，可以增加測試化合物的數(shù)量，并快速獲得全血中細胞因子分泌的數(shù)據(jù)，為在生理環(huán)境中測試化合物創(chuàng)造了理想的方法平臺。
