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引言：膽堿是一種水溶性B族維生素，在水溶液中以四價(jià)銨陽(yáng)離子形式存在，是 正常代謝*的物質(zhì)。準(zhǔn)確分析全血樣品中的膽堿，對(duì)于代謝等生物領(lǐng)域 具有很重要的作用，是新型反應(yīng)急性冠脈綜合癥的指標(biāo)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域意義重 大。同時(shí)膽堿（Choline）作為一種營(yíng)養(yǎng)食品添加劑，具有促進(jìn)大腦的發(fā)育、改 善大腦的代謝、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞、增強(qiáng)視力、改善鈣的代謝等功能[1]。
國(guó)標(biāo)中檢測(cè)膽堿的方法有GB/T 5413.20-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉 膽堿的測(cè)定》[2]，該方法采用酶水解，分光光度法進(jìn)行測(cè)定，成本高效率低。 近年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道食品中膽堿的測(cè)定方法為液相色譜法[3]和離子色譜法[4-6]，液相 色譜法一般采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，而此檢測(cè)器非常用檢測(cè)器，該 方法不易推廣。離子色譜電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，易推廣，在 食品檢測(cè)方面應(yīng)用較多，但是應(yīng)用于全血樣品中膽堿的檢測(cè)鮮有報(bào)道。血樣 不同于常規(guī)的食品樣品，不易分散。實(shí)驗(yàn)室采用曲那通-X100對(duì)血樣進(jìn)行分散 處理后，采用鹽酸水解，離子色譜進(jìn)行檢測(cè)。方法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確可靠，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果滿足檢測(cè)的要求。

 

測(cè)試條件：
儀器和試劑
賽默飛ICS-3000離子色譜系統(tǒng)（美國(guó)Dionex公司），電導(dǎo) 檢測(cè)器；自動(dòng)進(jìn)樣器及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)處理工作 站；MiliQ-Element純水機(jī)（法國(guó)Millipore）；KQ-500E型 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水 浴鍋（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）；0.22 µm尼龍濾膜。 膽堿酒石酸氫鹽（純度98.0%，日本TCI試劑） ； MiliQ-Element超純水；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，北京化工廠）；曲 拉通X-100（化學(xué)純，西隴化工股份有限公司）；甲烷磺 酸（色譜純，sigma公司）。文中所用血樣為雞血樣品。
色譜條件
色譜柱：IonPac CS12分析柱 （250 mm×4 mm）和 IonPac CG12保護(hù)柱（50 mm×4 mm）； 淋洗液：甲烷磺酸（16 mmol/L）； 抑制器：CSRS 300 4 mm ，外接水抑制模式。 進(jìn)樣體積：100 µL。
 

樣品前處理方法：
準(zhǔn)確稱取約2 g全血樣品（真空采樣，保存于4 ℃ 冰箱中可保持30天）于50 mL具塞玻璃錐形瓶中，加入 27.5 mL 1.0%的曲拉通-X100溶液，超聲15 min，再加 入1.5 mL鹽酸，加蓋，混勻。將錐形瓶放入70 ℃水浴 3小時(shí)，每小時(shí)搖一次。將水解產(chǎn)物冷卻至室溫，用水 沖洗錐形瓶，所得溶液過(guò)濾至容量瓶中，將濾液定容至 100 mL，此濾液可以在4 ℃下保存三天。分析前用水繼續(xù) 稀釋此濾液10倍后，過(guò)0.22 µm尼龍濾膜。同時(shí)準(zhǔn)備試劑 空白。

結(jié)果和討論：
前處理?xiàng)l件的選擇
血樣不同于粉末的食品樣品，凝固后很難在水溶液中 均勻分散，會(huì)大大的影響提取效率。實(shí)驗(yàn)室采用了0.5 % 曲拉通X-100溶液（一種表面活性劑）對(duì)血樣進(jìn)行分散， 并且采用超聲提取以提高提取率。實(shí)驗(yàn)室考察了超聲時(shí) 間（15 min、30 min、45 min、60 min）對(duì)提取效率的影 響，從圖1可以明顯的看出，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到15 min后， 提取率就沒(méi)有明顯的變化，因此實(shí)驗(yàn)室選擇15 min作為超 聲時(shí)間。

同時(shí)也考察了水解溶液中鹽酸的用量，選擇某血 樣，研究采用不同的鹽酸溶液配是否會(huì)影響血樣的水解 效率，不同的鹽酸配比條件采用實(shí)驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行 檢測(cè)，所得結(jié)果見(jiàn)表1。 方法1鹽酸用量越大，所得濾液酸度較高，若直接 進(jìn)樣會(huì)使陽(yáng)離子交換官能團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化，色譜峰嚴(yán)重變 形，因此必須再稀釋5倍后再進(jìn)樣。而采用方法2和方法 3進(jìn)行前處理，所得濾液酸度就適合直接進(jìn)樣分析，且已 經(jīng)滿足了水解的效果。方法3稀釋倍數(shù)增大一倍，樣液 中膽堿的含量也能達(dá)到檢出限的要求，且溶液更容易過(guò) 濾，可以進(jìn)一步提高工作效率，所以實(shí)驗(yàn)室采用了方法3 的鹽酸用量進(jìn)行前處理。
 

色譜柱的選擇
在常用的陽(yáng)離子色譜柱中，IonPac CS17色譜柱同 樣可以分析血樣中的膽堿，淋洗液濃度為6 mM的甲烷磺 酸，對(duì)于IonPac CS17色譜柱分析奶粉中的膽堿色譜峰 對(duì)稱性更好，所用淋洗液濃度低。但鈉離子、銨離子和 鉀離子的分離度不好，并且IonPac CS17更容易發(fā)生陽(yáng) 離子交換官能團(tuán)的質(zhì)子化現(xiàn)象，與IonPac CS12A色譜柱 相比，前處理后的溶液需要多稀釋5倍后進(jìn)樣。可能會(huì) 影響含量較低的血樣的定量。所以實(shí)驗(yàn)室采用了IonPac CS12A作為檢測(cè)用色譜柱，等度淋洗。對(duì)于分離效果較 好的新的色譜柱來(lái)說(shuō)，淋洗液的濃度不超過(guò)20 mmol/L 均能滿足分離的要求。由于血樣中成分較為復(fù)雜，鉀含 量較高，如果淋洗液濃度太高，鉀離子拖尾現(xiàn)象比較嚴(yán) 重，所以終采用了16 mmol/L作為淋洗液條件

結(jié)論：
本方法采用鹽酸酸解，使全血樣品中的膽堿釋放出 來(lái)，前處理方法對(duì)膽堿提取效率高。處理后的樣品溶液 使用IonPac CS12A色譜柱分析，抑制電導(dǎo)檢測(cè)，膽堿色 譜峰型良好，檢測(cè)靈敏度高，且可以同時(shí)測(cè)定其他5種常 見(jiàn)陽(yáng)離子。