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摘要： 質(zhì)量控制是中藥 (TCM) 行業(yè)中重要的任務(wù)之一。在質(zhì)量控制中，要求用 HPLC 方 法測(cè)定 TCM 中主要化合物的含量。鑒于 TCM 樣品的復(fù)雜性，目標(biāo)化合物有可能與 其他微量化合物在 HPLC 分離中發(fā)生共洗脫。二維液相色譜是一個(gè)采用正交色譜柱 化學(xué)鍵合相和流動(dòng)相的強(qiáng)大方法，該方法可分離復(fù)雜樣品。本應(yīng)用簡報(bào)詳述了如何 開發(fā)用于翼首草 (Pterocephali Herbra) 中齊墩果酸和熊果酸定量分析的高分辨率采樣 二維液相色譜方法。

 

前言 中藥 (TCM) 分析是一項(xiàng)挑戰(zhàn)的任 務(wù)，因?yàn)闊o論是一種草藥還是復(fù)方制劑， 含有的成分都非常復(fù)雜。為控制 TCM 的 質(zhì)量，需要使用《中國藥典》(CHP) 中規(guī) 定的 HPLC二維液相色譜 方法測(cè)定其中主要化合物的含 量。通常來說，其他化合物將與目標(biāo)化合 物發(fā)生共洗脫，從而影響定量準(zhǔn)確度。 在《中國藥典》中，翼首草是一個(gè)需要 用 HPLC 方法測(cè)定齊墩果酸和熊果酸（圖 1）兩種目標(biāo)化合物含量的示例。本研究 發(fā)現(xiàn)，其他幾種化合物會(huì)與齊墩果酸和熊 果酸發(fā)生共洗脫，使現(xiàn)有方法不足以對(duì)這 些化合物進(jìn)行定量分析。

 

 為實(shí)現(xiàn)正交分離，本應(yīng)用簡報(bào)使用兩根選 擇性不同的 Agilent InfinityLab Poroshell 120 色譜柱（EC-C18 和 Phenyl-Hexyl）， 并在高分辨率采樣二維液相色譜中采用了 不同的流動(dòng)相條件。在選定時(shí)間范圍內(nèi)收 集幾個(gè)涵蓋一維色譜圖中整個(gè)峰面積范圍 的小體積餾分，以此測(cè)定兩個(gè)目標(biāo)化合 物。每次切割都駐留在采樣環(huán)中，并在第 二維中對(duì)所有切割進(jìn)行連續(xù)分析。這一模 式可確保所有選定化合物均轉(zhuǎn)移至第二 維，并在其中得到分析。因此，選定的共 洗脫化合物都接受了高分辨率采樣處理， 以在第二維中得到分析。如之前出版的技 術(shù)概述1 所示，這一操作可實(shí)現(xiàn)可靠的定 量分析。

 

實(shí)驗(yàn)部分 化學(xué)品和樣品 所有試劑和溶劑均為 HPLC 級(jí)。乙腈和 甲醇購自 JT Baker, USA。乙酸銨購自 北京百靈威科技有限公司。新制超純 水產(chǎn)自 ELGA 水純化系統(tǒng)，Lane End, UK。翼首草提取物以及齊墩果酸和熊 果酸對(duì)照品由中國當(dāng)?shù)匾患抑扑幑咎?供。將齊墩果酸和熊果酸同時(shí)溶于甲醇 中配制儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液，二者濃度分別為 2.3 mg/mL 和 2.0 mg/mL。 儀器 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜包括 以下模塊： • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) • Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備樣品冷卻裝置（選 件 #100） • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II MCT (G7116B) • 兩臺(tái) Agilent 1290 Infinity II DAD (G7117B)，配備 10 mm 大光強(qiáng) 卡套式流通池 (G4212-60008) 和 60 mm 大光強(qiáng)卡套式流通池 (G4212- 60007) • Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A) 和 2 位/4 通雙向閥（二維 液相色譜閥頭，G4236A） • 兩個(gè) Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng) (G1170A)，配備帶 40 µL 定量環(huán)的 多中心切割閥 (G4242-64000) 

 

 高分辨率采樣方法設(shè)置 高分辨率采樣方法設(shè)置參考了之前發(fā)布 的技術(shù)概述1 。圖 3 顯示 Agilent 1290 Infinity II 二維液相色譜的高分辨率采樣配 置，包括 2 位/4 通雙向閥，與帶有 12 個(gè) 定量環(huán)的多中心切割閥相連。采用這一設(shè) 置后，多可對(duì) 10 次連續(xù)切割進(jìn)行采樣 與儲(chǔ)存以待分析。對(duì)于高分辨率采樣，為 避免發(fā)生任何樣品損失，建議定量環(huán)充填 量大為 80%。圖 4 顯示了二維泵的使 用方法設(shè)置。首先，運(yùn)行一維液相色譜分 離樣品，并將色譜圖加載為參比信號(hào)預(yù)覽 窗口。基于時(shí)間高分辨率采樣以目標(biāo)峰為 依據(jù)，8 次切割涵蓋了整個(gè)峰寬。在給定 一維條件下，采樣時(shí)間為 8.63 秒，相當(dāng) 于 72% 的定量環(huán)填充。

 

結(jié)果與討論 分離 圖 5 顯示采用根據(jù) CHP 方法的優(yōu)化方 法，對(duì)翼首草中的齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行 分析得到的典型色譜圖。在這一方法中， 采用 InfinityLab Poroshell 120 4 µm 為對(duì) 照品提供了良好的分離度，而樣品極其復(fù) 雜，因此目標(biāo)分析物未能與其他干擾化合 物實(shí)現(xiàn)充分分離。因此，使用傳統(tǒng)一維液 相色譜分離無法對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定量 分析。 使用高分辨率采樣二維液相色譜可將這兩 種目標(biāo)化合物從干擾化合物中分離，實(shí)現(xiàn) 正確的定量分析。利用不同選擇性的色 譜柱化學(xué)鍵合相可達(dá)到這一目的。在 2.7 和 1.9 µm 表面多孔顆粒填料上引入多 種化學(xué)鍵合相，使 InfinityLab Poroshell 120 色譜柱成為實(shí)現(xiàn)二維 HPLC 分離所 需正交分離的選擇。該方法使用 Phenyl-Hexyl 色譜柱作為。齊墩 果酸和熊果酸兩種目標(biāo)化合物在 Agilent InfinityLab Poroshell 120 Phenyl-Hexyl, 2.1 × 100 mm, 1.9 µm 色譜柱上實(shí)現(xiàn)了 基線分離，如圖 6A 所示。亞 2 µm 表面 多孔顆粒填料 Poroshell 色譜柱對(duì)兩個(gè)窄 峰寬化合物表現(xiàn)出高柱效和良好的分離 度，使二維分離采樣更輕松。第二維分 離使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18, 3.0 × 50 mm, 2.7 µm 色譜柱。這 款色譜柱反壓低，可采用高流速使目標(biāo)化 合物與共洗脫化合物實(shí)現(xiàn)快速分離。使 用高分辨率采樣，對(duì)包含齊墩果酸和熊 果酸色譜峰的時(shí)間范圍進(jìn)行 8 次切割采 樣（圖 6A），并進(jìn)樣至第二維進(jìn)行分析 （圖 6D）。