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摘要：本文采用 Agilent 1290-II 四元梯度液相色譜系統(tǒng)，結(jié)合具有表面多孔填料的 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色譜柱，在農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準《巴氏殺菌乳和 UHT 滅菌乳中復原乳的鑒定》(NY/T 939-2016) 的基礎上建立了快速、高靈敏度分析奶制品中糠氨酸 (Furosine) 的超高效液相色譜 (UHPLC) 方法。該方法可分析不同基質(zhì)奶制品中的糠氨酸，分析速度快、分離效果好，且雜質(zhì)對分析的影響小。

 

前言：糠氨酸的含量測定是奶制品的評測方法之一。大量文獻表明，奶制品經(jīng)高溫處理后品質(zhì)會受到不同程度的影響，而糠氨酸正是奶制品經(jīng)高溫處理后發(fā)生美拉德反應的產(chǎn)物，因此測定奶制品中糠氨酸的含量是衡量其經(jīng)高溫處理后變化程度的手段之一。通常情況下，采用巴氏滅菌法消毒的奶制品因處理溫度不高且處理時間不長等因素，而與未經(jīng)處理的原奶相似，其中的糠氨酸含量較低，而成品奶粉因處理方式不同等原因，糠氨酸含量高很多。因此在農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準中，將糠氨酸的含量測定作為區(qū)分巴氏殺菌乳和 UHT 滅菌乳中復原乳的手段之一。[1]、[2] 糠氨酸的極性很強，在普通反相 C18 色譜柱上的保留不好，不容易與經(jīng)強酸處理后產(chǎn)生的大量極性雜質(zhì)分離。因此所用色譜條件比較特殊，需要使用離子對試劑或極低比例的有機相才能勉強分離極性雜質(zhì)。而使用離子對試劑又會對色譜柱造成很大傷害，導致色譜柱變性并降低方法的一致性。而有機相比例低的色譜條件則需要特殊的耐水性色譜柱及高性能色譜儀器配合。這給糠氨酸的測定帶來了困難。[3]

安捷倫標志性的 SB-C18 是業(yè)界非常廣泛使用的耐酸色譜填料，而采用表面多孔填料技術的 Poroshell 120 硅膠基質(zhì)是一種先進的超高效色譜基質(zhì)，可在壓力升高不多的同時實現(xiàn)柱效的提升。相比離子對試劑，在采用超高效液相色譜法分析糠氨酸時使用 Poroshell 120 SB-C18 色譜柱，將對行業(yè)標準的推廣帶來巨大利益。

 

 

實驗部分：試劑和樣品甲醇、三氟yi酸為色譜純級，購于迪馬公司；實驗用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；糠氨酸標準品由用戶提供；脫脂奶粉、A2 嬰兒奶粉樣品及原奶分別由不同的用戶提供，巴氏殺菌奶購自市場。儀器和設備 Agilent 1290 Infinity II 四元梯度液相色譜系統(tǒng)，配備如下安捷倫組件： – 1290 Infinity II 全能泵（部件號 G7104A）或 1260 Infinity II Prime 泵（部件號 G7104C） – 帶柱溫箱的 1290 Infinity II 型自動樣品瓶進樣器（部件號 G7129B 或 G7129C） – 1290 Infinity II 二極管陣列檢測器（部件號 G7117A），配備光程 10 mm 的標準光導纖維流通池本實驗選用的安捷倫色譜柱為：Agilent Poroshell 120 SB-C18， 4.6 × 100 mm，2.7 μm（部件號 685975-902）。標準品制備參照行業(yè)標準 (NY/T 939-2016) 的方法，用戶提供已配置好的 2 mg/L 標準樣品（溶于濃鹽酸）。樣品前處理參照行業(yè)標準 (NY/T 939-2016) 的樣品處理方法，用濃度為 10.6 mol/L 的 HCl 水解奶制品樣品并加熱，24 小時后取出，冷卻后用 0.45 μm 的醋酸纖維膜過濾。取 300 mL 濾液，加 1.0 mL 6 g/L 醋酸鈉水溶液混合；用 0.22 μm 水相濾膜過濾后進樣液相色譜條件色譜柱： Poroshell 120 SB-C18, 4.6 × 100 mm, 2.7 μm 流速： 1.0 mL/min 柱溫： 35 °C 流動相： A：0.1% 三氟yi酸 (TFA) B：甲醇

 

結(jié)果與討論：本實驗選擇了糠氨酸含量差異較大的幾種代表性奶制品作為樣品，分別是用戶提供的脫脂奶粉、普通嬰兒配方奶粉、A2 嬰兒配方奶粉、全脂奶粉、原奶及市場上售賣的的全脂巴氏消毒鮮牛奶等六種奶制品。圖 1 是六種不同種類奶制品與標準樣品的疊加色譜圖，以及各樣品中糠氨酸的疊加光譜圖。如圖所示，各樣品的糠氨酸組分與各自含有的雜質(zhì)實現(xiàn)了良好分離，樣品及標準樣品的糠氨酸峰保留時間重現(xiàn)性非常好。從小圖中的疊加光譜可以看出，所有糠氨酸的紫外光譜圖能很好重疊，說明色譜峰的純度很高，基本沒有雜質(zhì)的干擾，即使是糠氨酸含量很低的原奶和巴氏消毒奶的糠氨酸光譜圖也能很好地重疊。很多文獻中都有提及，樣品中的基質(zhì)經(jīng)常會造成標準樣品與樣品的保留時間不一致。一個文獻沒有提到的原因是，低比例梯度對儀器的梯度性能要求較高，但并不是所有儀器都能滿足要求。保留時間的不穩(wěn)定也是造成測定低含量樣品時糠氨酸峰位置不確定，需要通過 LC/MS 來定性與定量分析的原因之一。

結(jié)論本實驗使用 Poroshell 120 SB-C18 色譜柱，在農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準的基礎上建立了準確、快速、重現(xiàn)性好的奶制品中糠氨酸分析的超高效液相色譜方法。該方法使用性能優(yōu)異的 1290 Infinity II 四元梯度泵，或全新的 1260 Infinity II Prime 泵，在 0%-5% 的低比例有機相梯度條件下仍能保持很好的重現(xiàn)性。相比行業(yè)標準在超高效液相色譜方法中施行的等度條件，該方法具有更高的靈敏度，每次進樣均采用高比例有機相沖洗雜質(zhì)并進行平衡，可有效除去干擾雜質(zhì)、避免雜質(zhì)對分析的干擾，從而延長色譜柱的壽命，并使總分析時間縮短。使用自動進樣器后，無需用強有機溶劑清洗針內(nèi)部，因此可以采用純水作為針外壁及針座的清洗溶液，有效避免了樣品中的高濃度鹽酸對進樣器針座的腐蝕。

 

參考文獻 1. 農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準：巴氏殺菌乳和 UHT 滅菌乳中復原乳的鑒定 (NY/T 939-2016) 2. Anatol Schmidt, Lisa I. Boitz, Helmut K. Mayer. A new UHPLC method for the quantitation of furosine as heat load indicator in commercial liquid milk. Journal of Food Composition and Analysis. 56 (2017) 104–109 3. 付洪濤、歐陽華學、雪紹芳，高效液相色譜法測定復原乳中糠氨酸的含量，中國測試技術，Vol. 34 No.2. 2008 年 3 月