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摘要：本文介紹了用于普通 HPLC上的快速液相分析方法。文中使用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 色譜柱分析槐角苷對(duì)照品及銀杏葉提取物制品，目標(biāo)物峰形良好，能夠有效 與樣品中的雜質(zhì)分離，得到準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。同時(shí)與采用 Agilent 5 TC-C18 (2) 色譜柱的 常規(guī)方法進(jìn)行對(duì)比，本方法經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的方法轉(zhuǎn)換，即可縮短約 60% 的分析時(shí)間。該方法 適用于銀杏葉提取物中槐角苷的快速、高效分析。

 

前言： 銀杏葉中主要活性成分為黃酮類化合物，具有一定的擴(kuò)血管作 用，可輔助治療心腦血管疾病。市場(chǎng)上有各種銀杏制品，銀杏葉 片、軟膠囊和滴丸皆為常見(jiàn)的銀杏葉提取物制品。但銀杏中還含 有有毒的銀杏酸，在提取工藝中需盡可能減少銀杏酸成分含量。 為了保證銀杏葉制品的質(zhì)量，《中國(guó)藥典》中明確規(guī)定了銀杏葉 提取物檢測(cè)總黃酮醇苷含量及銀杏酸*。其中總黃酮醇苷的含 量，由分別測(cè)得的槲皮素含量、山柰素含量及異鼠李素含量按照 公式換算獲得。 槐角提取物中同樣含有槲皮素、山柰素及異鼠李素，并且不含有 毒成分銀杏酸。但從銀杏葉與槐角兩味藥材在《中國(guó)藥典》中的 描述看到，兩者功效不同。在生產(chǎn)過(guò)程中存在以槐角苷提取物代 替銀杏葉提取物的現(xiàn)象屬于摻假行為，而原有方法無(wú)法區(qū)分。 中國(guó)食品藥品檢定研究院研究制定了多個(gè)有關(guān)銀杏葉制品的檢 測(cè)方法，并發(fā)布了《銀杏葉軟膠囊中槐角苷檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢查方 法》。此方法采用 Agilent 5 TC-C18 (2) 色譜柱（4.6 × 250 mm， 5 μm，部件號(hào) 588925-902），簡(jiǎn)單有效，可準(zhǔn)確測(cè)定槐角苷的 含量。 本文在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了快速液相色譜方法，采用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 色譜柱（4.6 × 100 mm，2.7 μm，部件號(hào) 685975-902），在 20 min 內(nèi)完成分析，大大縮短分析時(shí)間。同時(shí) 兼容常規(guī)液相色譜系統(tǒng)，可在普通液相色譜系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)快速分析 需求

 

 實(shí)驗(yàn)部分：儀器與試劑 采用 Agilent 1260 Infinity 液相色譜系統(tǒng)，配備如下安捷倫模塊： 四元泵（部件號(hào) G1311A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào) G1367D）、柱 溫箱（部件號(hào) G1316A）、二極管陣列檢測(cè)器（部件號(hào) G4212A）。 色譜柱選用 Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（4.6 × 100 mm, 2.7 μm，部件號(hào) 685975-902）。 甲醇、乙腈、磷酸為色譜純級(jí)，購(gòu)于迪馬公司；所用實(shí)驗(yàn)用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統(tǒng)現(xiàn)制備的高純?nèi)ルx子水；槐角苷對(duì)照 品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；樣品為市售產(chǎn)品。 槐角苷對(duì)照品溶液配置 取槐角苷對(duì)照品適量，精密稱定，加 80% 甲醇水溶液制成每 1 mL 含 20.0 μg 槐角苷對(duì)照品的溶液，作為對(duì)照品溶液。 樣品前處理 取約相當(dāng)于總黃酮醇苷 9.6 mg 的樣品粉末，精密稱定，置于 具塞錐形瓶中，精密加入 80% 甲醇水溶液 20 mL，密塞，稱定 重量，超聲處理 20 min。取出，放冷，再稱定重量，用 80% 甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾。取續(xù)濾液，待測(cè)。 液相色譜條件 色譜柱： InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 流速： 1.0 mL/min 進(jìn)樣量： 4 μL 柱溫： 40 °C 流動(dòng)相： A) 0.4% 磷酸水溶液 B) 乙腈 C) 甲醇 梯度程序： 時(shí)間 (min) A% B% C% 0.0 77 8 15 8.0 67 8 25 16.0 42 8 50 16.1 77 8 15 20.0 77 8 15 檢測(cè)器：260 nm

 

結(jié)果與討論：按照本文所述實(shí)驗(yàn)方法，使用 InfinityLab Poroshell 120 SB-C18 色譜柱，對(duì)銀杏葉軟膠囊中的槐角苷進(jìn)行分析，分析結(jié)果滿足分 離及檢測(cè)要求，槐角苷對(duì)照品溶液和樣品溶液的色譜圖如圖 1、2 所示。 其中，兩個(gè)待測(cè)樣品中二號(hào)樣品為已知陽(yáng)性樣品，一號(hào)樣品為未 知樣品。按照《銀杏葉軟膠囊中槐角苷檢查項(xiàng)補(bǔ)充檢查方法》中 結(jié)果判斷方法，使用槐角苷對(duì)照品定位，并比對(duì) 210-400 nm 波 長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光譜圖，二號(hào)樣品判定為陽(yáng)性檢出，與已知結(jié)果 一致；一號(hào)樣品中保留時(shí)間相同的色譜峰，由于光譜圖不同（槐 角苷在 259 nm 顯示大吸收），判定為合格產(chǎn)品，對(duì)照品溶液、 樣品溶液的疊加光譜圖如圖 3 所示。 通過(guò)進(jìn)一步對(duì)比常規(guī)柱方法和本文所述快速方法的色譜圖得到， 在保證分離及檢測(cè)要求的前提下，快速方法可在 20 min 內(nèi)完成 分析，縮短了約 60% 的分析時(shí)間，如圖 4 所示。

 

結(jié)論 ：此方法使用采取表面多孔層填料技術(shù)的 Poroshell 色譜柱，利用 其柱效與亞二微米填料相當(dāng)?shù)奶攸c(diǎn)，在滿足分離度的基礎(chǔ)上，達(dá) 到快速分析的效果。同時(shí) Poroshell 色譜柱的壓力大約只有亞二 微米填料的 50%，可應(yīng)用于 UHPLC 和常規(guī) HPLC 系統(tǒng)上。 本文隨機(jī)選取兩個(gè)不同廠家的銀杏葉軟膠囊，按照建立的快速方 法檢測(cè)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，Poroshell 120 SB-C18 能夠提供較好 的分離及良好的峰形，滿足方法中柱效不低于 40000 的要求。且 方法分析周期 20 min，縮短了約 60% 的分析時(shí)間，大大提升分析 效率。此外，本文所述方法操作簡(jiǎn)便，可準(zhǔn)確測(cè)定槐角苷的含量。