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技術(shù)文章

PCR產(chǎn)物跑不出來?xiàng)l帶原因參考

閱讀:15631          發(fā)布時(shí)間:2022-3-23


PCR是分子生物學(xué)的常規(guī)和常用手段,用途很多,但是都是通過擴(kuò)增目的基因片段來實(shí)現(xiàn)的。

那么,首先需要搞明白的是,需要擴(kuò)增的基因片段大小是多大,因?yàn)椴煌笮〉幕蚱纹鋽U(kuò)增的難度是有差異的,尤其過長(zhǎng)的片段,需要使用不同的taq酶來進(jìn)行擴(kuò)增(比如LA taq)。幾點(diǎn)容易發(fā)生問題的地方供參考:

1.引物,PCR是基于引物來實(shí)現(xiàn)的。引物是否是自己設(shè)計(jì)的?如果是,需要檢查一下引物設(shè)計(jì)的是否合理。如果是從文獻(xiàn)中選取的,一般出問題的可能性不大,不放心的可以在數(shù)據(jù)庫比對(duì)一下,防止文獻(xiàn)出錯(cuò)。

2.模板,一般來講通過試劑盒提取的DNA質(zhì)量都是可以保證的,也能在4℃冰箱放置較長(zhǎng)的時(shí)間,仍能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。要是通過煮沸法粗提的DNA就沒辦法放置太長(zhǎng)時(shí)間了。一句話就是,模板DNA的濃度要合適。

3.反應(yīng)條件,這一塊就比較復(fù)雜了,特別是對(duì)自己設(shè)計(jì)的引物來說,選擇合適的退火溫度,是需要慢慢摸索的,一般根據(jù)計(jì)算的退火溫度降低5~10℃來進(jìn)行首chi擴(kuò)增,如果出現(xiàn)了目的條帶,且有雜帶時(shí),在逐步提高退火溫度,以提高反應(yīng)的特異性。

此外,還有反應(yīng)體系,電泳條件等等因素。

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