導(dǎo)讀：CRISPR是一種出色的基因組編輯工具，深受研究人員的歡迎。其中，大家比較熟悉的是來自化膿鏈球菌的Cas9（SpCas9）。不過，這并不是wei一的選擇。一種新型核酸酶Cas13a（以前稱為C2c2）正逐漸走進(jìn)人們的視野，它具有*的性質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR工具箱。在此，我們將介紹一下Cas13a的*性質(zhì)以及各種應(yīng)用。

Cas蛋白的分類

根據(jù)Cas蛋白的分類和效應(yīng)復(fù)合物的性質(zhì)主要分為兩大類Class 1和Class 2，六種不同類型。
1類系統(tǒng)包括類型I、III、IV，效應(yīng)復(fù)合物由多個Cas蛋白 （具有一個或多個內(nèi)切酶活性組分） 組成并與crRNA緊密結(jié)合，
2類系統(tǒng)包括類型II、V和VI，只有一個具有內(nèi)切酶活性的多結(jié)構(gòu)蛋白。
II類CRISPR-Cas系統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)已用于基因敲除和敲入以及基因組標(biāo)記等,方便基因操作和基因組研究。
而VI類系統(tǒng)又叫CRISPR-Cas13系統(tǒng)，是向?qū)NA介導(dǎo)的RNA靶向的內(nèi)切酶系統(tǒng)，從15年被發(fā)現(xiàn)至今一共鑒定出四個亞型：
VI-A(Cas13a/C2c2),VI-B(Cas13b),VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)
已經(jīng)開始運(yùn)用于RNA的敲低，RNA定點編輯，RNA檢測以及RNA剪接調(diào)控

Cas13a的*之處

Cas13a初是由Broad研究所的研究人員發(fā)現(xiàn)的。2015年，Shmakov及其同事利用Cas1作為“誘餌”，來鑒定細(xì)菌基因組中與CRISPR相關(guān)聯(lián)的蛋白。通過此次分析，他們鑒定出53個候選基因，總共分成三大類：C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3與Cpf1有些類似，不過它們需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目標(biāo)，而Cpf1僅需要crRNA。

再來看C2c2（也就是Cas13a）與Cas9的區(qū)別。大的區(qū)別在于Cas13a結(jié)合并切割RNA，而Cas9切割DNA。從結(jié)構(gòu)上來看，Cas13a含有兩個HEPN結(jié)構(gòu)域，而Cas9用HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域來切割DNA目標(biāo)。HEPN結(jié)構(gòu)域?qū)as13a切割RNA目標(biāo)是必需的。另外，與Cas9類似，Cas13a分子中關(guān)鍵殘基的突變可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a（dCas13a），它能夠結(jié)合RNA目標(biāo)但無法切割。

表1：比較常用的CRISPR酶

Cas13a的作用機(jī)制

大家都知道，Cas9利用tracrRNA和crRNA來實現(xiàn)與DNA目標(biāo)的結(jié)合和切割。不過，Cas13a只需要24個堿基的crRNA，它通過富含尿嘧啶的莖環(huán)結(jié)構(gòu)與Cas13a分子相互作用，并通過Cas13a的一系列構(gòu)象變化來促進(jìn)目標(biāo)的切割。與Cas9一樣，Cas13a也能容忍crRNA與目標(biāo)序列之間的單個錯配，不過若存在2個錯配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列（相當(dāng)于PAM序列）位于間隔區(qū)的3’端，由A、U 或C堿基組成。

Cas13a還有一個特別之處，那就是Cas13a一旦識別并切割由crRNA序列的RNA目標(biāo)，它就轉(zhuǎn)入了一種酶促“激活”狀態(tài)，這時它將結(jié)合并切割其他的RNA，而不管它們是否與crRNA同源，或是否存在PFS。這一點與Cas9截然不同。對于細(xì)菌而言，這種性質(zhì)是有意義的。若細(xì)菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細(xì)胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個群體中的傳播。

Cas13a的潛在應(yīng)用

那么，Cas13a可以應(yīng)用在哪些方面呢？對于初學(xué)者來說，Cas13a可用來結(jié)合和切割RNA目標(biāo)，不過這方面的應(yīng)用可能受限，因為一旦目標(biāo)被破壞，Cas13a就會失去控制。因此，Cas13a的突變體研究有望成為新的熱點，使其特異切割RNA目標(biāo)，但是隨后不會切割非特異的RNA。此外，人們可利用dCas13a來分離群體中的特定RNA序列，或利用熒光標(biāo)記的dCas13a來研究活細(xì)胞中的RNA加工。

近，張鋒實驗室還發(fā)表了一篇文章，證明了Cas13a可以高特異性地檢測RNA單分子。他們開發(fā)出的SHERLOCK系統(tǒng)可檢測血清、尿液和唾液中低濃度的寨卡病毒，并確定病毒載量，區(qū)分不同病毒株。它還可以對人類DNA進(jìn)行基因分型，并鑒定游離DNA中的腫瘤突變。未來，Cas13a有望繼續(xù)擴(kuò)大CRISPR的應(yīng)用范圍。田克恭團(tuán)隊建立了新方法：Crispr-Cas13a可視化檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)