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上海精瑞科學儀器有限公司

PATfix系統(tǒng)下使用不同洗脫液對 AAV 空/實衣殼分析分離的改進

時間:2023-11-9閱讀:274
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 CIMac AAV Empty/Full 分析柱是AAV生產過程中快速分析,尤其是對AAV實衣殼和空衣殼進行定量的利器。盡管新的色譜化學和方法使我們有可能以更接近AUC(分析型超速離心技術)的方式來區(qū)分空衣殼和實衣殼(請繼續(xù)關注更新?。?,但是目前現(xiàn)有的方法側重于提高空衣殼和實衣殼兩個同質群體之間的分辨率。

根據(jù)Wang等人的前期工作(報道季銨鹽-QAS與NaCl相比能更好地實現(xiàn)空衣殼和實衣殼的分離),BIA實驗室將四甲基氯化銨(TMAC)和氯化膽堿與NaCl一起進行測試。此外BIA實驗室也測試了上述所有鹽在添加MgCl2后的色譜性能(Mihevec et. Al, 2023)。

實驗設計

將先前通過陽離子交換色譜(CIMmultusTM SO3)捕獲的AAV2/8血清型樣品在緩沖液A中稀釋,上樣至CIMacTM AAV empty/full -0.1分析柱(3.66E + 11 vg/CV)。

PATfix系統(tǒng)(BIA Separations)用于色譜分析。

檢測器設置

  
  • 電導率和pH值

  • 吸光度(260nm,280nm),50 mm UV流通池

  • 熒光(激發(fā)/發(fā)射:280/348 nm)

  • 光散射(角度:90°)

流動相

 

緩沖液A:

  • 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl2+ 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液B:

  • 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl2+ 400 mM NaCl + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

  • 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl2+ 450 mM TMAC + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

  • 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl2 + 400 mM 氯化膽堿 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液C:1 M NaOH + 2 M NaCl

緩沖液D:1 M 乙酸銨

方法

用100 柱體積(CV)緩沖液B(洗脫液)進行從0%至100%的梯度洗脫。按照指導手冊的方法進行柱平衡和原位清洗(CIP)(使用緩沖液A進行2分鐘柱平衡,再用緩沖液C用于原位清洗1分鐘,之后使用緩沖液D清洗去除NaOH。最后使用緩沖液A使電導率和pH值恢復到緩沖液基線水平)。

根據(jù)標準方程? = 2 ?F − ?E / ?F + ?E,基于熒光計算峰間分離度:,其中 tF和 tE是保留時間,wF 和 wE 是AAV實衣殼和空衣殼基線處的峰寬。根據(jù)熒光信號也計算了AAV空衣殼和實衣殼的百分比(% E和% F),一些色譜圖中也對UV和光散射進行了比較。

結果

篩選不同的洗脫鹽:

在不添加2 mM MgCl2情況下,使用三種不同配方的緩沖液B:每個色譜圖顯示2至3個重疊峰。空衣殼在第一個和第三個峰中洗脫分離(使用TMAC和氯化膽堿的緩沖液,第三個峰未分離),實衣殼在第二個峰中洗脫。使用季銨鹽觀察到更高的AAV空/實衣殼分離度,但第三個未分離的峰看起來像實衣殼峰的延長拖尾。

 在添加2 mM MgCl2情況下,使用三種不同配方的緩沖液B:每個色譜圖顯示兩個重疊的峰。第一個峰為空衣殼,第二個峰為實衣殼。向緩沖液中添加鎂會導致分離度降低,并使所有洗脫鹽的洗脫曲線更統(tǒng)一。然而,空衣殼峰的響應增加并且峰變窄。
 

 色譜峰積分示例,主餾分顯示在相應的色譜峰中。生成以下色譜圖時未添加鎂:

 

 

 所有測試鹽(紫外、熒光和光散射信號)在有或無 MgCl2 的情況下的色譜疊加圖:

使用NaCl作為洗脫鹽,有MgCl2(實線)/無MgCl2(虛線)的色譜疊加圖。

不添加Mg可見三個分離峰。
 

 使用TMAC作為洗脫鹽,有MgCl2(實線)/無MgCl2(虛線)的色譜疊加圖。

如果不添加MgCl2,則無法分離第三個峰。洗脫電導率更高(對使用NaCl梯度以低電導率洗脫的血清型可能有用)。
 

 使用氯化膽堿作為洗脫鹽,有MgCl2(實線)/無MgCl2(虛線)的色譜圖疊加。

如果不添加MgCl2,則無法分離第三個峰。與TMAC相比曲線相似,但洗脫電導率更低。
 

 實驗結果總結

基于熒光信號的AAV實衣殼的

分辨率和百分比
 

 要點:

向緩沖液中添加鎂會降低分離度,但會改善所有洗脫鹽的洗脫曲線。這意味著只有兩個峰被分離,左峰是空衣殼AAV,右峰是實衣殼AAV。盡管NaCl分辨率較低,但有氯化鎂時,如果在兩峰之間的最低信號處畫垂直線到X軸用作區(qū)分空AAV衣殼和實AAV衣殼,則能顯示出與無氯化鎂時相似的實衣殼百分比(詳見上圖示例)。

與NaCl相反,季銨鹽(TMAC,氯化膽堿)在無氯化鎂時導致更寬的峰,更高的空/實衣殼分離度,并且第三個空衣殼峰洗脫于峰尾并沒有與實衣殼峰分離。然而,添加 MgCl2時季銨鹽顯示出比NaCl更好的分離度。其中一個可能的原因是它們作為去離液鹽,可以穩(wěn)定空病毒衣殼和實病毒衣殼之間的疏水作用。

歡迎嘗試上述的方法!如果需要幫助,請與我們取得聯(lián)絡。

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