根據(jù)Wang等人的前期工作（報(bào)道季銨鹽-QAS與NaCl相比能更好地實(shí)現(xiàn)空衣殼和實(shí)衣殼的分離），BIA實(shí)驗(yàn)室將四甲基氯化銨（TMAC）和氯化膽堿與NaCl一起進(jìn)行測試。此外BIA實(shí)驗(yàn)室也測試了上述所有鹽在添加MgCl₂后的色譜性能（Mihevec et. Al, 2023）。

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實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將先前通過陽離子交換色譜（CIMmultus^TM SO3）捕獲的AAV2/8血清型樣品在緩沖液A中稀釋，上樣至CIMac^TM AAV empty/full -0.1分析柱（3.66E + 11 vg/CV）。

PATfix系統(tǒng)（BIA Separations）用于色譜分析。

檢測器設(shè)置

• 電導(dǎo)率和pH值

• 吸光度（260nm，280nm），50 mm UV流通池

• 熒光（激發(fā)/發(fā)射：280/348 nm）

• 光散射（角度：90°）

流動(dòng)相

緩沖液A：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液B：

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 400 mM NaCl + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂+ 450 mM TMAC + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0 或

• 20 mM BTP + 0/2 mM MgCl₂ + 400 mM 氯化膽堿 + 1% 山梨糖醇 + 0.1% poloxamer pH 9.0

緩沖液C：1 M NaOH + 2 M NaCl

緩沖液D：1 M 乙酸銨

方法

用100 柱體積（CV）緩沖液B（洗脫液）進(jìn)行從0%至100%的梯度洗脫。按照指導(dǎo)手冊的方法進(jìn)行柱平衡和原位清洗（CIP）（使用緩沖液A進(jìn)行2分鐘柱平衡，再用緩沖液C用于原位清洗1分鐘，之后使用緩沖液D清洗去除NaOH。最后使用緩沖液A使電導(dǎo)率和pH值恢復(fù)到緩沖液基線水平）。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程? = 2 ?_F − ?_E / ?_F + ?_E，基于熒光計(jì)算峰間分離度:，其中 t_F和 t_E是保留時(shí)間，w_F 和 w_E 是AAV實(shí)衣殼和空衣殼基線處的峰寬。根據(jù)熒光信號也計(jì)算了AAV空衣殼和實(shí)衣殼的百分比（% E和% F），一些色譜圖中也對UV和光散射進(jìn)行了比較。

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結(jié)果

篩選不同的洗脫鹽：

在不添加2 mM MgCl₂情況下，使用三種不同配方的緩沖液B：每個(gè)色譜圖顯示2至3個(gè)重疊峰。空衣殼在第一個(gè)和第三個(gè)峰中洗脫分離（使用TMAC和氯化膽堿的緩沖液，第三個(gè)峰未分離），實(shí)衣殼在第二個(gè)峰中洗脫。使用季銨鹽觀察到更高的AAV空/實(shí)衣殼分離度，但第三個(gè)未分離的峰看起來像實(shí)衣殼峰的延長拖尾。

 在添加2 mM MgCl₂情況下，使用三種不同配方的緩沖液B：每個(gè)色譜圖顯示兩個(gè)重疊的峰。第一個(gè)峰為空衣殼，第二個(gè)峰為實(shí)衣殼。向緩沖液中添加鎂會導(dǎo)致分離度降低，并使所有洗脫鹽的洗脫曲線更統(tǒng)一。然而，空衣殼峰的響應(yīng)增加并且峰變窄。
 

 色譜峰積分示例，主餾分顯示在相應(yīng)的色譜峰中。生成以下色譜圖時(shí)未添加鎂：

 所有測試鹽（紫外、熒光和光散射信號）在有或無 MgCl2 的情況下的色譜疊加圖：

使用NaCl作為洗脫鹽，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜疊加圖。

不添加Mg可見三個(gè)分離峰。
 

 使用TMAC作為洗脫鹽，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜疊加圖。

如果不添加MgCl₂，則無法分離第三個(gè)峰。洗脫電導(dǎo)率更高（對使用NaCl梯度以低電導(dǎo)率洗脫的血清型可能有用）。
 

 使用氯化膽堿作為洗脫鹽，有MgCl₂（實(shí)線）/無MgCl₂（虛線）的色譜圖疊加。

如果不添加MgCl₂，則無法分離第三個(gè)峰。與TMAC相比曲線相似，但洗脫電導(dǎo)率更低。
 

 實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)

基于熒光信號的AAV實(shí)衣殼的

分辨率和百分比
 

 要點(diǎn)：

向緩沖液中添加鎂會降低分離度，但會改善所有洗脫鹽的洗脫曲線。這意味著只有兩個(gè)峰被分離，左峰是空衣殼AAV，右峰是實(shí)衣殼AAV。盡管NaCl分辨率較低，但有氯化鎂時(shí)，如果在兩峰之間的最低信號處畫垂直線到X軸用作區(qū)分空AAV衣殼和實(shí)AAV衣殼，則能顯示出與無氯化鎂時(shí)相似的實(shí)衣殼百分比（詳見上圖示例）。

與NaCl相反，季銨鹽（TMAC，氯化膽堿）在無氯化鎂時(shí)導(dǎo)致更寬的峰，更高的空/實(shí)衣殼分離度，并且第三個(gè)空衣殼峰洗脫于峰尾并沒有與實(shí)衣殼峰分離。然而，添加 MgCl₂時(shí)季銨鹽顯示出比NaCl更好的分離度。其中一個(gè)可能的原因是它們作為去離液鹽，可以穩(wěn)定空病毒衣殼和實(shí)病毒衣殼之間的疏水作用。

歡迎嘗試上述的方法！如果需要幫助，請與我們?nèi)〉寐?lián)絡(luò)。