PPB即表示與血漿蛋白結(jié)合形成結(jié)合態(tài)藥物的比例。游離藥物假說認(rèn)為僅有游離態(tài)的藥物才能擴(kuò)散透過生物膜，到達(dá)靶部位發(fā)揮藥效；另外游離藥物的比例還顯著影響藥物分布、代謝和排泄的過程，PPB與藥物的諸多藥理性質(zhì)均有關(guān)。
影響PPB測定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結(jié)合、酯酶代謝等，需根據(jù)化合物的特征，結(jié)合研究的實(shí)際目的，選擇合適的測定方法反應(yīng)真實(shí)的化合物特性。需根據(jù)化合物預(yù)期治療濃度，個性化的制定試驗(yàn)濃度，必要時進(jìn)行不同濃度條件下的PPB測定。其中對于*蛋白結(jié)合率的化合物，試驗(yàn)的微小偏差即會對結(jié)果造成較大的相對偏差，此時還需要同步優(yōu)化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等檢測分析技術(shù)。
平衡透析法目前是常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡狀態(tài)的改變、非特異性結(jié)合、體積變換、Donnan效應(yīng)和蛋白滲漏等。
初始平衡狀態(tài)的改變是指當(dāng)游離藥物穿過半透膜時會形成新的游離態(tài)-結(jié)合態(tài)的平衡，由此造成試驗(yàn)設(shè)置濃度與實(shí)際平衡濃度的差異，對于PPB存在濃度依賴特性的化合物可能造成結(jié)果的偏差。
非特異性結(jié)合是指藥物與半滲透膜等試驗(yàn)裝置的結(jié)合，可能造成游離藥物濃度的低估，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果。通常采用聚四氟乙烯(Teflon)制造的試驗(yàn)裝置以降低非特異性結(jié)合的影響。如果非特異性結(jié)合現(xiàn)象比較嚴(yán)重建議采用超速離心法。
體積轉(zhuǎn)換是指液體在膠體滲透壓的作用下從buffer側(cè)移動至蛋白側(cè)，由此稀釋蛋白濃度對結(jié)合率較低的化合物試驗(yàn)結(jié)果造成影響。當(dāng)液體轉(zhuǎn)換比例低于10%時該效應(yīng)幾乎忽略，孵育時間超過4h可能會加劇該效應(yīng)，可以通過在buffer側(cè)加入右旋糖酐以平衡兩側(cè)滲透壓。
Donnan效應(yīng)是指吉布斯-唐南效應(yīng)，是指帶電粒子不通過半透膜而產(chǎn)生不均勻的電荷，使兩側(cè)粒子濃度不一致。尤其對于高離子化且低蛋白結(jié)合的藥物，該效應(yīng)最為明顯，該效應(yīng)可以通過增加buffer側(cè)電解質(zhì)的濃度來弱化。
當(dāng)半透膜完整性出現(xiàn)問題時會發(fā)生蛋白滲漏現(xiàn)象，對于高蛋白結(jié)合率化合物，由此會造成游離藥物比例的顯著高估，尤其在孵育時間過長時易發(fā)生。
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