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光學(xué)顯微鏡的觀察方式之熒光介紹
光學(xué)顯微鏡的觀察方式中，熒光觀察是一種重要且廣泛應(yīng)用的技術(shù)。以下是對熒光觀察的詳細介紹：
一、熒光現(xiàn)象與原理
熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，指的是某些分子在吸收特定波長的光線（激發(fā)光）后，能夠再發(fā)射出其他波長的光線（發(fā)射光）。這種分子被稱為熒光團，其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光能量比激發(fā)光低，波長比激發(fā)光長，這個差值稱為“斯托克斯位移"。熒光現(xiàn)象包括自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光兩種，自發(fā)熒光是指樣品自帶熒光團，經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光，如葉綠體；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，樣品經(jīng)照射后不能發(fā)出熒光，需先用熒光染料標記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光顯微鏡主要利用的是繼發(fā)熒光。
二、熒光顯微鏡的構(gòu)造與部件
熒光顯微鏡是利用熒光特性進行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，其構(gòu)造主要包括以下幾個關(guān)鍵部件：
熒光光源：用于提供熒光激發(fā)光，核心規(guī)格是光譜特征波長，要求能覆蓋染料的激發(fā)特征波長，并提供足夠光強。常用的熒光光源有汞燈、氙燈、金屬鹵素?zé)粢约癓ED熒光光源。其中，LED熒光光源在開關(guān)性能、使用壽命、光強可控性和免維護等方面具有顯著優(yōu)勢。
熒光激發(fā)塊：一組激發(fā)塊由激發(fā)濾光片、發(fā)射濾光片和二向分光鏡組成。激發(fā)濾光片只讓特定波長激發(fā)光通過，用以激發(fā)特定熒光染料；發(fā)射濾光片匹配熒光染料特性，只讓特定波長的發(fā)射熒光通過；二向分光鏡反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。熒光激發(fā)塊的作用是篩選特定的激發(fā)光和發(fā)射光，透過目標熒光信號。
熒光臂/熒光模塊：用來安裝熒光光源和激發(fā)塊的載體，核心規(guī)格是通道數(shù)和光源接口，影響配件適配和擴展性。
此外，熒光顯微鏡還可能配備有外置快速轉(zhuǎn)輪等部件，以實現(xiàn)高速多色實驗。
三、熒光顯微鏡的應(yīng)用
熒光顯微鏡廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)以及醫(yī)療診斷、產(chǎn)業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域。其具體應(yīng)用包括：
生物學(xué)研究：借助熒光染料標記，熒光顯微鏡可準確而詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分和活動，如細胞和亞微觀細胞結(jié)構(gòu)、細胞生理、動物生理病理等。
醫(yī)療診斷：熒光顯微鏡可用于原位熒光雜交技術(shù)（FISH）檢測癌癥、呼吸道病毒檢測、真菌鏡檢等。
產(chǎn)業(yè)應(yīng)用：在材料科學(xué)領(lǐng)域，熒光顯微鏡可用于檢測礦物、紡織、紙張等材料的成分；在藥品檢測方面也有重要應(yīng)用。
四、熒光顯微鏡的成像優(yōu)勢
熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點，非常適合進行特定蛋白、細胞器等在組織及細胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，以及離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤。此外，熒光顯微鏡還可實現(xiàn)活體、離體、標記、自發(fā)等多種方式的熒光成像，對樣本限制較少。
五、熒光顯微鏡的注意事項
在使用熒光顯微鏡時，需要注意以下幾點：
選擇合適的熒光染料：熒光染料的選擇應(yīng)基于其激發(fā)和發(fā)射光譜特性，以及與目標樣本的兼容性。
優(yōu)化光源和濾光片：確保熒光光源的光譜特征波長能夠覆蓋染料的激發(fā)特征波長，并選擇合適的濾光片以匹配染料的激發(fā)和發(fā)射光譜。
控制光毒性與熒光染料毒性：在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內(nèi)的有機分子在與氧反應(yīng)時吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。
綜上所述，熒光觀察作為光學(xué)顯微鏡的一種重要觀察方式，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)以及產(chǎn)業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景和重要的研究價值。