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雄性Wistar大鼠
DMEM 胎牛血清 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液
手術(shù)器械 眼科剪 眼科鑷 培養(yǎng)皿 手術(shù)刀 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱
1. 頸椎脫臼處死大鼠，將整個(gè)大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1 min。在無菌狀態(tài)下，逐層剪開胸腔，分離取出主動脈，放含無菌 D-Hanks’液培養(yǎng)皿中。
2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后，用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的凝血數(shù)次，再放入另一無菌培養(yǎng)皿中。
3. 用眼科剪縱向剪開血管，平展在培養(yǎng)皿中。用非常銳利的手術(shù)刀將其切成1 mm3大小的動脈植 塊(或者用剪刀剪，依照個(gè)人習(xí)慣)，然后種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(培養(yǎng)瓶或皿用1%明膠預(yù)置 37℃下過夜， 使用前2h 移入CO2培養(yǎng)箱中。用時(shí)可以先經(jīng)含 10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗)。將動脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸，種植密度約為 1 塊/cm2 。
4. 置培養(yǎng)箱中靜置2 h(干貼壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養(yǎng)液，液量以略蓋過動脈植塊內(nèi)膜面，而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后，更換培養(yǎng)液，加入 2-3 ml 培養(yǎng)液。
5. 72 h 左右的時(shí)候，當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長出，而成纖維細(xì)胞剛要長出的時(shí)候，將動脈植塊除去，刮除成纖維細(xì)胞，換培養(yǎng)液1 次。以后每2 天換液一次，每次換1/2~1/3 的液量。繼續(xù)培養(yǎng) 8-10 d， 細(xì)胞融合成單層，即可傳代。
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