常規(guī)維持培養(yǎng)

1. 通過刮取法或用培養(yǎng)液沖洗細胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或從甘藍環(huán) Trichoplusia ni 獲得的細胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也稱 “High Five "，可從 Invitrogen 購買））法使細胞從培養(yǎng)瓶中脫落，或者利用在旋轉(zhuǎn)瓶中懸浮生長的細胞。

2. 用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞，通過用臺盼藍或萘黑染色檢査細胞的活力。

3. 以 0.5~1×106 個/ml 活細胞密度將細胞種植于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶內(nèi)，每 500 ml 旋轉(zhuǎn)瓶內(nèi)注入 20~100 ml 細胞懸液。

4. 在 20~28°C 條件下培養(yǎng)細胞，以 37°C 為佳。

5. 每 48~72 h 或當(dāng)細胞密度為 4~5×106 個/ml 時，將細胞稀釋至 0.5~1×106 個/ml。

6. 每 3~4 周將細胞移入潔凈的培養(yǎng)瓶。

7. 如果細胞群聚集，稍微加快攪拌速度，并加入表面活性劑 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。

凍存細胞

1. 計數(shù)細胞，離心（1000 rpm ，約 200 g，5 min )。

2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混懸細胞，密度為 1×107 個/ml。

3. 將細胞分裝入凍存管，然后將凍存管放在冰上 1 h。

4. 將凍存管裝入苯乙烯泡沫容器。

5. 在 -70°C 條件下將凍存管緩慢冷凍過夜（約 1°C /min )。

6. 將凍存管移入液氮凍存器中。

7. 使凍存的細胞復(fù)蘇時，將凍存管在 37°C 迅速融化。如果細胞以液相儲存，在融化加蓋容器中的細胞時應(yīng)注意避免因凍存管破裂而導(dǎo)致受傷的危險。

8. 將細胞移入含 5 ml 培養(yǎng)液的 25 cm2 培養(yǎng)瓶。輕拍培養(yǎng)瓶，以便均勻地分散細胞。

9. 2~3 h 后吸去培養(yǎng)液。當(dāng)大多數(shù)細胞貼壁時，加入 5 ml 新鮮培養(yǎng)液。

10. 在分離前將細胞培養(yǎng) 2~3 天，使細胞恢復(fù)。然后按前述方法，將細胞移入攪拌培養(yǎng)瓶或更大的塑料瓶。

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昆蟲細胞的擴增

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