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GST pull down實驗技術

時間:2021/9/23閱讀:4805
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GST Pull down實驗技術

1. 實驗原理

Pull down技術是將"誘餌"蛋白與一種易于純化的配體標簽(如:GST標簽、His標簽)進行融合表達,而帶標簽的誘餌蛋白能被特異結合該標簽的固相親和配基捕獲,形成"次級親和支持物",用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。純化產物洗脫后,經Western blot驗證或LC-MS/MS,即鑒定與誘餌蛋白互作的蛋白。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。從此,GST融合蛋白在蛋白質相互作用研究領域里得到了極大的推廣。GST融合蛋白在經過固定有谷胱甘肽(GSH)的色譜柱時,就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附。當再有細胞抽提物過柱,就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的興趣蛋白。GST pull down是一種體外驗證或篩選互作蛋白的技術。

GST pull-down.jpg

2. 實驗流程

圖片1.png

  1. 構建帶標簽的誘餌蛋白原核表達載體(帶GST標簽或His或);

  2. 載體轉化大腸桿菌,表達誘餌蛋白(關鍵步驟,很多蛋白原核表達時會形成包涵體,極大地影響后續(xù)實驗。我們采用自誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌,能有效降低包涵體的形成);

  3. 細菌裂解液過柱子,帶標簽的誘餌蛋白被特異結合標簽的固相化親和配基捕獲,產生"次級親和支持物";

  4. 待測樣品裂解液過柱子孵育,與誘餌蛋白互作的蛋白被“次級親和支持物"吸附;

  5. 清洗,離心,去除未結合的雜蛋白;

  6. 洗脫,得到誘餌蛋白及其互作蛋白的復合物;

  7. 如要驗證某個蛋白X與誘餌蛋白互作,則將6.所得的蛋白復合物與X蛋白的抗體孵育,做Western blot驗證;

  8. 如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白,則將6.所得的蛋白復合物進行LC-MS/MS鑒定。

3. 技術服務

  1. 原核表達載體構建;

  2. 融合蛋白的誘導表達和純化;

  3. pull down捕獲互作蛋白;

  4. Western blot驗證(兩種目標蛋白互作/兩種蛋白互作的結構域);

  5. LC-MS/MS鑒定可能的互作蛋白。

4. 交付結果

  1. 客觀公正的實驗原始數據和分析結果;

  2. 提供詳細、完整的實驗報告。

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