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細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟有哪些？
細(xì)胞培養(yǎng)是雜交瘤制備單克隆抗體過(guò)程中不能缺少的實(shí)驗(yàn)操作，細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)困難重重的事情，多少英雄都在細(xì)胞培養(yǎng)上自掛東南枝，本文就細(xì)胞培養(yǎng)的步驟及注意事項(xiàng)做一描述。
細(xì)胞培養(yǎng)步驟：
一、復(fù)蘇
1. 把凍存管從液氮中取出來(lái)，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動(dòng)。液體都融化后(大概1-1.5分鐘)，拿出來(lái)噴點(diǎn)酒精放到超凈工作臺(tái)里。 2. 把上述細(xì)胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中(用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細(xì)胞都洗下來(lái))，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細(xì)胞懸浮起來(lái)。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動(dòng)，使培養(yǎng)皿中的細(xì)胞均勻分布。 4. 標(biāo)好細(xì)胞種類(lèi)和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)基。 5. 3天換一次培養(yǎng)基。
二、傳代
1. 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)要傳代。 2. 把原有培養(yǎng)基吸掉。 3. 加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌?能覆蓋細(xì)胞就行)，消化1-2分鐘。 4. 細(xì)胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。 5. 用移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來(lái)。 6. 把細(xì)胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。 7. 倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細(xì)胞都吹起來(lái)。 8. 根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)把細(xì)胞傳到幾個(gè)培養(yǎng)皿中。一般，癌細(xì)胞分5個(gè)，正常細(xì)胞傳3個(gè)。繼續(xù)培養(yǎng)。
三、 凍存
把細(xì)胞消化下來(lái)并離心(同上)。用配好的凍存液把細(xì)胞懸浮起來(lái)，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過(guò)夜，然后放到液氮灌中保存。凍存液的配制： 70%的*培養(yǎng)基+20?S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。