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在細(xì)胞培養(yǎng)中常見的問題以及解決辦法
閱讀：396 發(fā)布時(shí)間：2022-6-7
在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞用于研究和生物制劑生產(chǎn)并非易事。它需要在許多領(lǐng)域取得成功，包括優(yōu)化培養(yǎng)基和條件、適當(dāng)?shù)脑O(shè)備、良好的技術(shù)和有效的協(xié)議。細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)化在提高生產(chǎn)力、確保細(xì)胞生長(zhǎng)和健康方面起著至關(guān)重要的作用，甚至是影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性的杠桿。因此，細(xì)胞培養(yǎng)科學(xué)家在促進(jìn)現(xiàn)有和新治療方法的發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)方面起著至關(guān)重要的作用。
細(xì)胞培養(yǎng)作為*的工具，從20世紀(jì)出現(xiàn)至今經(jīng)歷了巨大的變化。從60多年前基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM的誕生到今天細(xì)胞培養(yǎng)成為生物醫(yī)藥、組織工程和再生醫(yī)學(xué)主流研究中*的部分，難以想象，如果沒有了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，生命科學(xué)研究將會(huì)是什么樣子。
很多人都繞不開養(yǎng)細(xì)胞這個(gè)坎，稍不留神，就給我們?cè)斐蓛?nèi)心陰影面積三室一廳。不是栽在細(xì)胞污染上，就是活力不好，怎么避免細(xì)胞不明不白的掛掉？我們來看一下。
培養(yǎng)細(xì)胞死亡的原因有哪些？
1.培養(yǎng)箱內(nèi)無 CO2
2.培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動(dòng)太大
3.細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷
4.培養(yǎng)液滲透壓不正確
5.培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積
遇到以上問題該如何應(yīng)對(duì)？
1.檢測(cè)培養(yǎng)箱內(nèi) CO2
2.檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度
3.取新的保存細(xì)胞種
4.檢測(cè)培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能耐受滲透壓為 260~350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES 或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。
5.換入新鮮培養(yǎng)液
而細(xì)胞培養(yǎng)做為生物學(xué)研究最基礎(chǔ)的技術(shù)之一，可以說是滲透科研界的方方面面。工欲善其事，必先利其器。細(xì)胞好不好，就看你懂不懂細(xì)胞培養(yǎng)的各種技術(shù)了。
一：原代培養(yǎng)
從原代組織中分離細(xì)胞的常用的方法是酶解法（胰蛋白酶和膠原酶）。
用無菌的解剖刀和剪子將組織剪成3~4mm小片，用平衡液（無鈣鎂離子）清洗組織碎片后去除上清液，并加入0.25%的胰蛋白酶（Trypsin，100mg組織加入1ml胰蛋白酶）或者膠原酶（Collagenase，50~200單位/ml），孵育4-18h。離心取上清后，用平衡液清洗幾次后，用*培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。
二：傳代培養(yǎng)
依據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的特點(diǎn)，傳代方法有3種：
1. 懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（離心法）
將懸浮細(xì)胞離心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培養(yǎng)基，混勻后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
2. 半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（直接吹打法）
此類細(xì)胞（如Hela細(xì)胞）部分貼壁，但黏貼不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來，進(jìn)行傳代。
3. 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（酶消化法）
去除瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)）37℃靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。移去蛋白酶液，加入培養(yǎng)液反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，離心將細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。吸取1/10—1/40細(xì)胞懸液，接種于含有適量新鮮培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。