【技術方案】微孔板內細胞固定和抗體染色自動化解決方案

時間：2024-1-19 閱讀：467

以往，我們使用顯微鏡做熒光成像的時候，常常將樣本放在載玻片上。但是隨著樣本量增加，細胞實驗使用 96 孔和 384 孔微孔板逐漸成為趨勢，這與高內涵（high-content analysis，HCA）分析不謀而合。

高內涵分析是一種高通量識別并分析由與細胞相互作用的物質所帶來的細胞表型變化的方法。這些物質包括小分子、受體配體和 RNAi，它們可能引起——增加或減少特定蛋白質產生的表型變化、G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的內化、核激素受體易位、細胞凋亡、蛋白質翻譯后修飾的變化以及細胞形態(tài)的變化。雖然通過明場成像（透射光）可以觀察一些細胞形態(tài)變化，但更多的形態(tài)學變化需要使用更有針對性的染色方案，比如抗體或者小分子熒光探針。

BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)支持高內涵成像與分析

無論使用何種抗體和熒光染料的組合，對于低背景的特異性染色，都需要一系列的試劑添加和清洗步驟來去除未結合的抗體或染料。

安捷倫 BioTek 406 FX 洗板分液系統(tǒng)是一個模塊化的系統(tǒng)，具備分液和細胞清洗雙重功能。406 FX 可以通過觸控屏或者使用電腦上 LHC 軟件進行控制和編程：

快速清洗 96/384 孔板，且無需更換洗頭；
最多 4 個注射器泵和 2 個蠕動泵分液器的組合允許同時添加 6 種試劑；
蠕動泵結合 1μL 卡夾，允許用戶最大限度的減少試劑制備量；
管路內的試劑可回收；
注射器泵支持快速批量分液。

406 FX 洗板分液系統(tǒng)

一臺 406 FX 即可完成 96/384 孔板中制備細胞樣品所需的試劑添加和清洗步驟。成角度分液頭的獨特設計，有效保護單層細胞不受加液和清洗影響。

下面我們就一起了解下 406 FX 細胞分液系統(tǒng)在如何代替手工，完成在微孔板中固定和染色細胞的工作流程。

實驗方法

細胞培養(yǎng)與接種

將 HT-1080 細胞和 NIH3T3 細胞通過 406 FX 的蠕動泵 5μL卡夾分別接種到 96 孔板（黑色，透明底，貨號：204626-100，安捷倫）中，再使用第二蠕動泵添加不含細胞的完整培養(yǎng)基，使得每個孔體積均為 200μL。

細胞固定、透化與熒光染色

所有固定、透化和熒光染色所需要的試劑添加和細胞清洗步驟均由 406 FX 來完成（圖 1）。其中，對于昂貴的一抗和二抗，使用蠕動泵來添加，管路中的試劑可回收。

用于透化細胞的固定劑和細胞洗液則使用注射器泵添加。實驗所涉及的試劑、抗體和染料和詳細實驗步驟請查看原文。

圖 1. 固定和染色工作流程

細胞成像分析

使用安捷倫 BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像系統(tǒng)對細胞進行成像和分析。Cytation C10 將共聚焦光路與寬場顯微成像相結合，對于寬場成像，Cytation C10 將 LED 光源與高性能濾光片 cube 直接耦合，提供多色熒光成像，在本次實驗中使用 DAPI、GFP、TRITC 和 CY5 四個熒光通道。對于共聚焦，Cytation C10 使用激光器結合轉盤共聚焦的方式為有厚度的樣本提供更優(yōu)異的分辨率和光學層切能力。

圖 2. HT-1080 細胞固定染色

使用 Agilent BioTek 406 FX 洗滌分配器進行液體處理，固定 HT-1080 細胞并對肌動蛋白（紅色）、微管蛋白（綠色）、細胞核（藍色）和線粒體（橙色）進行染色。使用 Agilent BioTek Cytation C10 共聚焦微孔板成像檢測系統(tǒng)用 40 倍物鏡拼接成像（2×2）。

結果與討論

可變細胞數接種準確性驗證

通過接種不同體積的細胞懸液，可以改變孔中的細胞數量。本實驗中，使用 406 FX 初級蠕動泵將相同細胞濃度的 NIH 3T3 細胞以不同體積接種至 96 孔板中，然后使用二級蠕動泵向孔內添加培養(yǎng)基，至每孔體積均為 200μL，固定細胞并使用 Hoechst 33342 染色后通過成像進行細胞計數，計數結果與接種細胞時基于細胞濃度預期的細胞數量具有良好的相關性（圖 3）。

圖 3. 可變細胞數接種

編程的靈活性驗證

406 FX 可以根據不同的實驗需求，在 2 個蠕動泵和 4 個注射器泵中靈活選擇進行程序設置，比如實現(xiàn)一個簡化版的固定和染色步驟。如圖 4 中的 NIH3T3 細胞表達 GFP，僅使用 DAPI 和 Texas Red 鬼筆環(huán)肽進行復染，其固定和染色過程僅使用了洗板模塊，一個蠕動泵和兩個注射器泵。

圖 4. 406 FX 固定和染色后的三色熒光成像圖。表達 GFP 的 NIH 3T3 細胞用 exas Red phalloidin（actin）染色，用 DAPI 染核。10 倍物鏡拍攝。

蠕動泵獨立分液，降本增效

406 FX 蠕動泵的卡夾采用 8 通道設計，8個通道既可以分裝相同的試劑，又可以分裝不同的試劑。8個通道獨立使用，在用來篩選熒光染料時可以節(jié)約染料和細胞，非常方便。圖 5 展示的是使用蠕動泵將不同的熒光染料組合加入到 4 個細胞孔里染色后的細胞圖像。

圖 5. 不同熒光標記的 phalloidin 復染結果

使用 406 FX 固定 HT-1080，再通過蠕動泵加入不同的染料組合，(A) Hoechst 33342 only；(B) Hoechst 33342 and AlexaFluor 488 phalloidin；(C) Hoechst 33342 and AlexaFluor 555 phalloidin；(D) Hoechst 33342 and CF633 phalloidin

該方法也同樣適用于檢測抗體特異性，檢測不同抗體的特異性時通常需要使用抗體陰性對照。如圖 6 所示，通過 406 FX 的一級和二級蠕動泵將6種不同的抗體混合物分別加入兩列細胞孔中，產生陰性對照：缺乏 rabbit anti-Tom20 一抗和對應二抗的孔不顯示紅色熒光，同樣，缺乏 mouse anti-tubulin 和對應二抗的孔不顯示綠色熒光。