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極速揭秘 | 10分鐘內(nèi)完成UV-Vis熱解鏈實(shí)驗(yàn)
寡核苷酸的熱解鏈實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的確認(rèn)測(cè)試，用于分析雙鏈結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，也是 PCR 反應(yīng)退火溫度的重要參考依據(jù)。
該實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)。通常的測(cè)試方法為測(cè)定核酸類(lèi)藥物在 260nm 處的吸光度值隨溫度變化的曲線。隨著溫度的升高，雙鏈結(jié)構(gòu)逐漸打開(kāi)，260nm 處的吸光度值逐漸升高，直至打開(kāi)成單鏈后吸光度值保持穩(wěn)定，當(dāng)雙鏈結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度定義為解鏈溫度（Tm 值）。
在此實(shí)驗(yàn)中，最重要的是要控制溫度的變化，傳統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)需要使用復(fù)雜的附件來(lái)控制溫度，例如，水控溫系統(tǒng)需要插額外的管線并進(jìn)行換水和清潔的工作。同時(shí)，測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)，至少需要 1 個(gè)小時(shí)以上才能完成。
借助 Cary3500 UV-Vis 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)可在 10 分鐘內(nèi)完成解鏈溫度的分析。
Cary3500 UV-Vis 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)采用帕爾貼風(fēng)冷控溫系統(tǒng)，升溫降溫全程電子控溫，無(wú)需額外管線。搭配溫度探頭觸達(dá)溶液，精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)溶液內(nèi)的溫度控制，同時(shí)，攪拌子可使每個(gè)樣品的溫度保持均勻，這樣就可以設(shè)置更快的升溫速率，縮短分析時(shí)間，且不會(huì)降低數(shù)據(jù)質(zhì)量。
Cary3500 UV-Vis 最快可設(shè)置 40℃/min 的升溫速率，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，不同的升溫速率下得到的 Tm 值的波動(dòng)小于 0.4℃。
圖 1. 鯡魚(yú)精子 DNA 吸光度與溫度 (A) 和相應(yīng)的一階導(dǎo)數(shù) (B) 作為升溫速率的函數(shù)
另外，Cary3500UV-Vis 多池控溫的選項(xiàng)，可以以快速升溫實(shí)現(xiàn) 4 個(gè)樣品的同時(shí)測(cè)試和慢速升溫實(shí)現(xiàn) 7 個(gè)樣品的同時(shí)測(cè)試。
下面，我們通過(guò)視頻來(lái)查看下 Cary3500 是如何實(shí)現(xiàn)熱解鏈溫度的測(cè)試的。
當(dāng)然，Cary3500UV-Vis 的操作軟件也可以與 Agilent OpenLab 軟件集成。OpenLab 提供技術(shù)控制來(lái)安全地獲取、處理報(bào)告和存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。對(duì)于必須遵循 FDA 21 CFR Part 11，歐盟附錄 11，GAMP5 以及 ISO/IEC 17025 和 EPA 40 CFR Part 160 合規(guī)指南的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，這些控制是不可少的。